流式细胞仪，利用光子学促进免疫学发展

　　新冠肺炎疫情的大流行使免疫学成为国际关注的焦点。该领域的研究人员一直在研究免疫系统对SARSCoV- 2 病毒的反应，以了解人的身体是如何抵抗病毒感染的。免疫学检测的进步尤其依赖于一种仪器，流式细胞仪。

　　“流式细胞仪对我们了解传染病很重要，”William Telford 表示，他是美国国家癌症研究所流式细胞仪核心设施的负责人之一。 纳米级流式细胞仪可以被用来描述 SARS-CoV-2 和其他病毒中发生的免疫变化。

　　William Telford 谈到：“免疫细胞在显微镜下看起来非常相似。只有当蛋白质在其表面显露才能反映出更多的信息，比如T 细胞还是B 细胞；激活还是灭活；疾病特异性还是非特异性等。我们正在发现越来越多的免疫细胞标志物。”Kinetic River 总裁兼创始人Giacomo Vacca 对 William Telford 关于COVID-19 和免疫学影响的看法表示赞同。他谈到，“在免疫学等领域，我们看到应用推动了对更好工具的需求。

　　像大多数生物医学工具一样，流式细胞仪是一种复杂的仪器，它依赖于包括流体力学、计算机科学以及光学和光子学在内的多学科融合。在典型的应用中，样本（例如异质细胞群）被荧光标记的抗体标记，然后注入微流体腔室，在该腔室中通过激光束激发荧光团，检测器记录发射和散射的光，并将结果发送到计算机进行分析。

　　虽然这项技术可以追溯到20 世纪50 年代，但目前设备的使用情况，已经完全看不到其原始样机的影子。一些最先进的设备要包含多达10 个激光器，它们可以发出不同波长的光束。William Telford 说：“我们已经看到技术的根本变化将继续影响该领域。” 在过去三十多年，他一直是该技术领域的研究人员和专家，他的设施为许多与美国国家癌症研究所合作的学术和临床研究人员提供了支持。

　　越来越多的标签

　　在过去十年，William Telford 见证了研究人员用来定义细胞群体的细胞表面标记物和荧光探针数量翻了一番。他说：“我们最多可以使用商业仪器对40 色荧光参数进行标记。我们正在利用各种各样的可见激光波长。”

　　Giacomo Vacca 说，这些参数的数量是很重要的，因为它们可以让科学家精确地描述看似相似的细胞群。然而，标签数量的增加也带来了潜在的挑战。荧光团的光谱尾很长，导致其发射物从一个检测通道溢出到另一个检测通道。因此，研究人员需要合适的激光器、检测器和计算算法，以区分重叠信号。Giacomo Vacca 补充说：“添加的标签越多，补偿问题就越复杂。

　　流式细胞仪和仪器制造商已经设计出增加研究人员可用标签数量的方法，而不必依赖诸如色彩补偿之类的数学过程，色彩补偿是用于区分光谱重叠。William Telford 说，一种方法是将标签推到可见光范围之外并进入紫外线。 Giacomo Vacca 同意这种方法：“在1990 年代后期将固态 355nm 激光器商业化引入之后，提供激发波长的流式细胞仪开始缓慢增长。化学家据此开发出了荧光团。”

　　William Telford 的实验室和其他实验室正在使用空间分离的连续波激光器，来激发可见光和紫外区域的荧光团。他谈到，探测技术也很重要，其研究团队已经开始使用电子崩光电二极管阵列来捕捉荧光信号，而不是传统的光电倍增管。

　　William Telford 表示，另一项获得关注的发展是光谱流式细胞仪。这种技术是迭代使用CCD 进行检测，它捕获每个激发荧光团的全光谱，而不是特定的发射波长。这样可以更好地区分标签。他认为10 年内光谱技术将成为主导技术。

　　Kinetic River 公司的Giacomo Vacca 则采取了不同的方法。为了补偿光谱重叠，该公司制造的流式细胞仪可以计算每个荧光团的荧光持续时间或寿命，而不仅仅是测量出其发射波长。然而，为了做到这一点，他们必须从连续波激光器切换到脉冲激光器。

　　“荧光寿命给了我们一个额外的参数来区分光谱相似的分子，”Giacomo Vacca 说，“你可以用多个荧光团标记细胞，例如所有荧光团都在蓝色区域发出，并通过测量信号衰减来区分它们。”通过在数据分析中添加补偿方法，他相信，细胞分析学家可以进一步增加参数的数量，超出目前可能的范围。William Telford 说：“通过观察，将会发现一些有趣的生物学应用。”

　　根据Giacomo Vacca 的说法，测量信号衰减的另一个好处是能够消除内源性荧光团，即自发荧光的背景。他说： “对所有实验者来说，这是一件令人讨厌的事，越深入紫外线区域，情况就越糟糕。”

　　激光解决方案

　　William Telford 和Giacomo Vacca 都将流式细胞仪的进展，归功于在可见光和紫外区域大量可选用的激光器。“关于流量的好处是，有了改进的光学器件和检测器，将不再需要大量的激光能量，”William Telford，“我们现在使用的是相对低功率的激光器，因为细胞在光束中的停留时间很短。”

　　硅谷初创企业

　　欧司朗光电半导体公司的高级应用工程师Ann Russell 回忆称：当年，流式细胞仪使用的激光器主要是气体离子工具，像大学宿舍冰箱一样大。她认为直接传输和二极管激光技术的进步有助于减小仪器的尺寸，同时提高其质量。“ 我们的单模激光束非常干净，它们正是流式细胞仪客户正在寻找的东西。”她补充说，改进的波导也有助于提高光束质量。

　　Ann Russell 指出，在当今的许多激光器上，研究人员可以通过调节二极管的温度，使其波长变化可达15nm。她说： “这就提供了一些额外的选择，即不必进入紫外线区域，因为紫外线会引起电离。”经济性和微型化的结合可以将流式细胞仪推向新的领域。在Ann Russell所在的北加利福尼亚州，生物技术初创公司通常会使用该技术。

　　William Telford 也看到了该领域的爆炸式增长。现在有比以往更多的工具和更多的公司。他认为可以执行自我分析的小型台式设备将在改善世界偏远地区个人健康方面发挥作用。例如，在加德满都的诊所不需要将易腐烂的样品送到印度的一家医院。大量使用这些仪器产生的数据可能会促进先进计算技术在流式细胞术的使用。“要拥有优秀的人工智能，你需要大量的数据支撑，”Ann Russell 说，“但我们人类擅长生成数据。”

　　William Telford 还指出了流式细胞仪数据分析改进的趋势，部分原因是可检测参数数量的增加。他说：“无论是人工智能还是机器学习，我们都开始采用人们一直使用的蛋白质组学和基因组学工具。这将帮助我们更好地可视化复杂的多参数数据，并获得我们之前无法获得的结果。”

　　纳米流

　　正如流式细胞仪越来越小一样，它们的靶标也越来越小。 Giacomo Vacca 说：“一个非常重要的研究领域是测量亚微米粒子。”亚微米和纳米级流式细胞术已经利用了技术改进的融合以及对短波长激光器的推动。

　　John Tilton 是凯斯西储大学的营养学副教授，他在该大学蛋白质组学和生物信息学中心指导免疫生物学项目。2020 年底，他的实验室报告使用纳米级流式细胞仪分析了感染该病毒的患者中HIV 蛋白酶活性的变异性。他说，这是该技术首次被用于直接测量酶活性，也是首次报道使用纳米级流量来观察患者来源的病毒。

　　John Tilton在使用流式细胞仪方面已有20多年的经验，并且他对确定病毒是否像细胞一样具有异质性非常感兴趣。他说：“当你在教科书中看到病毒图片时，它们看起来都很完美。但是我们知道他们实际上不是，并且我们想知道是否可以发现具有临床意义的差异。”

　　John Tilton 的小组表达了从感染了HIV 的患者细胞中提取的病毒基因序列，以及一个含有FRET（荧光共振能量转移）荧光标记对的报告基因构建体，这些荧光标记被HIV 蛋白酶切割位点隔开。研究人员用488nm波长激光刺激了该构建体，并开发了一种称为荧光阈值的技术，该技术可识别低水平的荧光，以检测发射的变化，这在以前可能会被当作背景排除。只有从病毒序列表达的活性蛋白酶才能有效地裂解该构建体，从而抑制了荧光共振能转移。 突变酶没有这种能力。

　　John Tilton 发现，HIV 蛋白酶活性的异质性反映了这些病毒的传染性以及它们对蛋白酶抑制剂的耐药性，蛋白酶抑制剂是HIV 治疗的主要形式之一。他进一步指出，由于病毒是如此之小，因此必须针对纳米级流式细胞术优化激光束宽度以及其他技术问题。但他认为，这项技术将会像细胞分析一样成为常规技术。John Tilton 说：“它的灵敏度真是令人难以置信。”他的实验室正在建造自己的仪器。

　　他说：“就更好地了解病毒和免疫学而言，我认为纳米级流式细胞仪发挥着重要作用。这对基于病毒颗粒的疫苗，基因疗法和癌症的病毒治疗具有重要意义。”William Telford 有同样的见解。他说：“这是一个令人兴奋的时刻，因为有很多新的仪器和技术正在开发中。”