支原体肺炎患者实验室检验的研究进展

　　赵霞 高磊*

　　【摘要】 支原体肺炎是较为常见的一种获得性肺炎，也是儿童与老年人群死亡的重要原因，加强对支原体肺炎患者的诊断尤为重要。目前血清学抗体等实验室检验方式是鉴别诊断支原体肺炎的重要手段，实验室检验常见生物标志物包括C反应蛋白、肺炎支原体抗体、乳酸脱氢酶和D-二聚体。实验室检验方法涵盖传统血清学检测、聚合酶链反应技术、实时荧光恒温扩增及高通量测序技术，不同方法各具优缺点，但均有助于提高支原体肺炎的诊断效率和准确性。因此，总结支原体肺炎实验室检验生物标志物及方法的优缺点，能为支原体肺炎的鉴别诊断提供新思路。

　　【关键词】 支原体肺炎；C反应蛋白；免疫球蛋白G；免疫球蛋白M；乳酸脱氢酶

　　中图分类号 R375.2 文献标识码 A 文章编号 1671-0223(2024)19-1441-05

　　支原体肺炎是一种由肺炎支原体引发的下呼吸道感染性疾病，其病原体主要通过飞沫或直接接触传播，可引起呼吸道及肺部炎症。支原体肺炎患者可有不同程度的发热、咳嗽等症状，严重的还可出现肺内外并发症，增加了临床治疗的难度，甚至会导致患者死亡[1-2]。目前肺炎支原体已成为社区获得性肺炎最常见的病原体。传统的支原体肺炎实验室检测方法主要包括血清学检测和微生物学检测，但血清学检测操作繁琐、耗时较长且需要专业人员操作，微生物学检测培养周期长、对实验条件和操作技能要求较高，难以满足临床快速诊断的需求[3]。随着分子生物学技术的快速发展，新型检测方法如聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、基因芯片以及生物信息学分析等逐渐应用于支原体肺炎的实验室检测[4]。这些新方法不仅特异性和敏感性高，还具有检测速度快、操作简便等优势。目前实验室检验是辅助CT等影像学鉴别诊断支原体肺炎的重要方式。现对支原体肺炎实验室检验生物标志物及方法进行综述。

　　1 支原体微生物特征

　　支原体是引起支原体肺炎的主要病原体，最早于20世纪80年代末被国外学者首次从胸膜肺炎牛体内分离出来的病株。20世纪40年代，另有国外学者从非典型肺炎患者呼吸道中分离出一种新的病原微生物，后续的研究证实这一病原微生物为支原体[5]。随着对这一病原微生物研究的不断深入，支原体生物学特征也逐渐显现。目前对人体有致病作用的支原体主要包括肺炎支原体、生殖支原体、解脲支原体、人型支原体和发酵支原体等5种，其中肺炎支原体与上呼吸道感染、支原体肺炎等呼吸系统疾病的发生密切相关[6]。

　　支原体是一种原核细胞病原体，其细胞结构和形体大小与病毒以及细菌等病原体有明显的差异，肺炎支原体的细胞体积大多小于细菌，且能够在体外独立存活，是能够不通过活体细胞而生存的最小病原微生物。因为肺炎支原体不具有细胞壁，所以通过作用于细胞壁的传统抗菌药物对支原体肺炎患者的治疗效果相对较差[7]。支原体由于其独特的生物学特性（如缺乏细胞壁、基因组小等），在合成及代谢上可能具有与细菌不同的特点，与细菌和病毒相比，支原体对于干燥以及高温环境更为敏感，所以不同季节儿童感染肺炎支原体的情况也存在较大差异，在秋冬季节更易高发[8]。

　　2 支原体肺炎实验室检验常见生物标志物

　　2.1 C反应蛋白

　　肺炎支原体容易引发肺部炎症，患者可出现不同程度的临床症状，常见的症状有咳嗽、咽痛、呼吸不畅等，部分患者可有明显的喘息、呼吸困难等症状。肺炎支原体感染的特点是肺部湿啰音出现较晚、患者临床症状一致性较差，这对临床诊断提出了更高的要求。支原体肺炎患者病情加重还可出现其他系统受累的表现，例如累及中枢神经系统时可出现急性播散性脑脊髓膜炎，累及心脏时可出现心内膜炎、心肌炎等，累及血液系统时可出现溶血性贫血等症状。而通过对支原体肺炎患者影像学检查可发现，肺部及周围组织炎性改变是最为明显的特征，X线检查可见均匀一致的片状阴影等，类似于大叶性肺炎的影像学特征[9]。因此，外周血白细胞计数等炎症标志物、血小板计数是支原体肺炎实验室检验常见的生物标志物。

　　C反应蛋白是由肝细胞合成的急性时相蛋白，能够借助增强吞噬细胞的吞噬功能消灭病原微生物，因此在上呼吸道感染、肺炎等感染性和炎症性疾病患者中异常升高。但C反应蛋白在支原体肺炎实验室诊断中的灵敏度低，所以越来越多的学者将高敏C反应蛋白应用于支原体肺炎实验室检验。与C反应蛋白相比，高敏C反应蛋白灵敏度更高，能够检出C反应蛋白的多种变化。颜廷娥[10]研究显示，高敏C反应蛋白诊断支原体肺炎的灵敏度近70.00%，特异度为91.89%。对于外周血白细胞计数等常规血清学检测指标无明显变化的早期支原体肺炎患者，高敏C反应蛋白检验可以提高诊断效能。有研究指出，支原体抗体可在支原体肺炎患者发病后72h左右生成，在1周内达到峰值，而特异性抗体免疫球蛋白M也会在1周左右开始升高[11]。因此，许多学者将肺炎支原体抗体联合高敏C反应蛋白、白细胞介素6等炎症标志物应用于支原体肺炎实验室检验中，从而提高诊断的灵敏度、特异度以及准确度，多项研究证实了这种联合检测的方式具有良好的应用效果[12-13]。

　　2.2 肺炎支原体抗体

　　单次测定肺炎支原体抗体阳性可作为诊断近期感染的依据，这主要是因为肺炎支原体是直径最小的病原微生物之一，感染后人体免疫系统会产生特异性抗体。其中，免疫球蛋白M抗体是提示近期感染较为敏感的指标，通常可在感染后1周左右升高，3周左右达到峰值，在肺炎支原体感染的3个月内实验室检查大多可见这一指标异常[14]。免疫球蛋白G抗体大多在肺炎支原体感染后5周左右达到峰值，提示患者既往有感染史，较少应用于支原体肺炎患者的早期诊断，但这一抗体与其他抗体指标以及C反应蛋白联合应用对于评估支原体肺炎患者的病情以及预后有重要意义。有研究证实，免疫球蛋白G诊断支原体肺炎患儿预后不佳的曲线下面积为0.644，灵敏度和特异度分别为62.50%、62.80%[15]。目前肺炎支原体抗体多与高敏C反应蛋白联合用于肺炎支原体实验室检验，从而提高诊断效能。有数据显示，肺炎支原体抗体与高敏C反应蛋白联合检测支原体肺炎的灵敏度和特异度分别为93.78%、92.45%，阳性预测值近84.00%[16]。

　　近年来随着对肺炎支原体血清学抗体检测研究的不断深入，P1蛋白等新的肺炎支原体已被应用于实验室检验。临床中利用血清学抗体检测方法能够检出实验动物与人体P1蛋白抗体水平变化，从而帮助医生评估支原体肺炎患者感染的大致时间与严重程度[17]。

　　2.3 乳酸脱氢酶

　　乳酸脱氢酶在人体无氧糖代谢过程中发挥着重要作用，作为氧化还原酶之一，其乳酸脱氢酶3亚型在肺组织中广泛存在。乳酸脱氢酶在厌氧条件下能够生成乳酸，当动物体内葡萄糖含量不足时，乳酸脱氢酶能够氧化乳酸并经过特定的途径转变为葡萄糖，在能量代谢过程中发挥重要作用。随着炎症反应的加剧，支原体肺炎患者肺部组织会出现不同程度的损伤，所以在实验室检验中也可通过检测乳酸脱氢酶明确诊断。研究显示，乳酸脱氢酶是支原体肺炎儿童患病的独立危险因素，尤其与儿童难治性支原体肺炎的发生有密切关系[18]。除辅助鉴别诊断支原体肺炎外，乳酸脱氢酶对预测支原体肺炎患者尤其是重症肺炎支原体患者心肌损伤也有重要应用价值[19]。因此，C反应蛋白、外周血白细胞计数等常规血清学指标检验与乳酸脱氢酶联合诊断支原体肺炎，尤其是较为特殊的支原体肺炎患者，能够预测心肌损害发生风险，从而及时采取有效的预防措施。

　　2.4 D-二聚体

　　部分支原体肺炎患者会因为血液高凝状态出现肾静脉血栓形成的并发症，进一步增加了临床诊疗的难度，也会增加患者预后不良的风险。肺炎支原体进入人体后会引起局部血管炎症，这一病原微生物的黏附也会破坏血管内皮细胞功能，人体内病原体数量越多，血管内皮细胞功能损害程度越严重，加之体内持续的炎症反应，也会进一步破坏细胞，最终导致凝血与纤溶系统失衡。支原体肺炎患者发病后免疫系统在病原体的刺激下被激活，出现抗原-抗体反应，大量释放的抗磷脂抗体可与磷脂结合蛋白发生反应，严重的可促进血液高凝[20]。凝血因子主要由肝脏产生，肺炎支原体感染后能够促进血小板成熟，还有可能造成肝功能异常，进而影响部分凝血因子的生成，导致凝血与纤溶系统失衡。

　　D-二聚体是纤维蛋白的降解产物，能够反映人体凝血功能的变化，一旦机体处于高凝状态或纤溶系统亢进，D-二聚体水平就会异常上升。支原体肺炎患者除C反应蛋白异常升高外，D-二聚体水平也明显升高，尤其是病情较为严重的支原体肺炎患者这一指标上升幅度更为明显。近年来多项研究表明，D-二聚体与支原体肺炎患者发生塑形支气管炎、进展为重症支原体肺炎有密切关系，是其独立危险因素[21-23]。因此，D-二聚体可以作为鉴别诊断支原体肺炎的生物标志物，其联合其他生物标志物能够更好地预测重症支原体肺炎，从而采取有效的措施防治重症支原体肺炎发生。

　　3 支原体肺炎实验室检验方法

　　3.1 传统实验室检验方法

　　传统支原体肺炎实验室检验方法主要包括血清学抗体检测方法与分离培养方式，以前者较为常见，主要是通过抗原抗体反应检测血样中肺炎支原体抗体含量，主要方法为酶联免疫吸附试验、凝集试验。利用酶联免疫吸附试验进行血清学检测是最为常见的一种实验室检验方法，有研究显示，酶联免疫吸附试验在肺炎支原体感染的诊断中具有明显优势，其阴性预测值、阳性预测值、特异度、灵敏度及准确度均明显优于冷凝集试验，此外，肺炎支原体感染和痰培养一致性检验结果显示，酶联免疫吸附试验的结果明显优于冷凝集试验，因此在早期肺炎支原体感染的检验中可以将酶联免疫吸附试验作为首选方法，从而降低误诊率和漏诊率[24]。但酶联免疫吸附试验存在操作繁琐、耗时长的不足，免疫荧光法与胶体金法的应用，在一定程度上弥补了酶联免疫吸附试验方法的不足，但对专业技术人员技能水平要求更高。其中免疫胶体金法操作简单，其能够通过末梢全血进行检验，而且需要血量较少，可以快速获得结果，尤其是在疑似肺炎支原体感染的门诊或急诊收治的患者检测中具有明显优势。而免疫荧光法则需要采用静脉血作为样本进行检验，其获得结果的速度较慢，主要适用于住院患者[25]。凝集试验具有操作简单、检测速度快、特异性高的特点，但其检测灵敏度低于酶联免疫吸附试验，可能难以区分自然感染与接种疫苗后免疫反应[26]。

　　3.2 PCR检验技术

　　PCR技术是诊断肺炎支原体常用的实验室检验方法，主要有变性、退火与延伸三个流程，这一检验技术的灵敏度高于较传统的血清学实验室检验方法。但传统PCR技术在检验过程中可能会因为交叉污染产生假阳性结果，且无法精确进行定量检测，在明确诊断支原体肺炎患者病情严重程度中有一定的局限性[27]。

　　随着对PCR技术研究越来越深入，融合荧光标记技术与PCR技术的定时荧光定量PCR检测已经逐渐替代传统PCR检验技术应用于支原体肺炎实验室检验。这一新型PCR技术是基于扩增产物累积效应，通过荧光信号强弱变化对肺炎支原体浓度进行定量分析[28]。从临床上看，实时荧光定量PCR检验对支原体肺炎有良好的诊断效果，特别是在早期患者的诊断中有独特优势，效果优于传统的酶联免疫吸附试验等方法。有研究指出，实时荧光定量PCR技术可以精确地识别肺炎支原体的不同类型变体，对肺炎支原体患者体内的部分耐药菌株也有良好的检验效果，在低DNA浓度下即可达到理想的检验效果，在数小时内即可检验出耐药菌株[29]。由此可见，实时荧光定量PCR检验在支原体肺炎患者实验室检验中具有广阔的应用前景。

　　3.3 实时荧光恒温扩增技术

　　传统实验室检验技术难以迅速、精确检出支原体，并同时检测其耐药性，在支原体分型诊断以及早期支原体肺炎患者诊断中具有一定局限性。随着分子生物学技术的快速发展，以DNA或RNA为检测靶标的新型检验技术被越来越多地应用于实验室检验，新技术的应用有效提升了支原体肺炎检验的诊断效果[30]。

　　实时荧光恒温扩增技术是将RNA等温扩增与荧光实时监测相结合的一种新型分子核酸检测技术，需要检验人员首先分离出检验样本中的16S rRNA，并将其通过多次转录后与荧光标记的特异性探针相结合，通过磁珠以及专业仪器捕捉荧光信号。基于这一操作原理，实时荧光恒温扩增技术的扩增效率优于传统实验室检验技术，通常可以在半小时内将模板扩增至109倍。同时，这一种分子核酸检测技术的灵敏度高于实时荧光定量PCR，且在检验过程中不容易产生交叉反应，可以有效保证检验结果的准确性。有研究数据显示，实时荧光恒温扩增技术鉴别诊断支原体肺炎的灵敏度和特异度可以达到81.00%、92.10%，检测结果与肺炎支原体抗体检测结果具有较好的一致性[31]。此外，采用实时荧光恒温扩增技术实施荧光闭管检测不容易污染实验室，而且也不需要PCR仪器，可在一定程度上降低实验室检验成本。

　　尽管实时荧光恒温扩增技术用于支原体肺炎检验诊断有独特优势，但对检验样本的储存、处理要求较高，否则容易产生假阴性结果，需要引起重视。总之，实时荧光恒温扩增技术在具体应用中的直接靶点为肺炎支原体的RNA，在早期诊断方面优势明显，建议将其作为肺炎支原体感染早期诊断的重要辅助手段[32]。由于大环内酯类药物治疗及患者的病程会在一定程度上影响实时荧光恒温扩增技术的检测结果，适用于无大环内酯类药物治疗史和发病早期的患者[33]。

　　3.4 高通量测序技术

　　高通量测序技术主要是借助蛋白质纳米孔网格以及电流干扰技术的一种新型检验技术，具有高灵敏度、快速的优点，而且随着技术的发展，这一种检验技术还可以精准识别病原体基因亚型[34]。基于该项技术在寨卡病毒检验方面的效果，已有学者将这项技术应用于支原体肺炎等肺部感染性疾病诊断，并取得了理想的效果[35]。然而，高通量测序技术在不同检测条件下的检验结果具有显著的差异，同时临床应用成本较高。

　　4 结语

　　C反应蛋白等常见生物标志物在支原体肺炎实验室检验中发挥着重要作用，乳酸脱氢酶等新生物标志物的出现与应用为支原体肺炎实验室鉴别诊断和心肌损伤等并发症的预测提供了更多的依据。传统实验室检验方法与PCR技术在支原体肺炎实验室检验方面存在一定的局限性，实时荧光恒温扩增技术等新型分子核酸检验技术的出现极大地提升了鉴别诊断支原体肺炎的灵敏度与特异度，未来还需要进一步研究。

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　　[2024-05-30收稿]

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