下一代细胞系开发：从分子水平提高精准度和生产率

　　综合编译：John Xie

　　生物疗法的概览

　　过去几十年来，药物开发领域发生了重大变化，尤其是在大分子生物治疗领域。在不断增长的市场中，生物治疗药物的治疗特异性带来了许多模式选择。与传统的小分子药物相比，大分子药物除了具有精确的靶向能力外，还有可能带来更高的经济回报。借鉴生物疗法的成功经验，生物仿制药也正在被开发为具有成本效益的替代品，以取代价格高昂的第一代药物。

　　对于大分子药物的发现和开发，技术的重点是推进价值链的上游和下游阶段。对药物设计上游关键因素的关注，使公司能够预测和预防可能导致药物审批延误或代价高昂的召回的下游问题。从单克隆抗体到双特异性抗体和多特异性抗体，再到纳米抗体和重组蛋白，生物治疗的重要性在各种类型中不断扩大。每种方式都提供了多种预防或治疗疾病的选择，如风湿病、癌症、糖尿病、贫血、传染病等。

　　细胞系开发，曲折的历程

　　生物治疗药物开发的上游工作流程在细胞系开发（cell linedevelopment，CLD）、克隆选择、放大、自动化和数字化方面取得了重大进展，从而提高了精确度和生产率。生物治疗价值链上的这些变革性进步也有助于提高灵活性和监管合规性。新冠疫情加快了将药物推向市场的进程，同时还能保持较高的质量、安全性和有效性标准。从 COVID-19 的经验中，作为科学家和创新者，我们了解到疫苗、小分子和大分子药物以及相关生物治疗药物的开发需要药物开发商、技术提供商、供应链组织和监管机构在全球范围内开展更多合作。

　　CHO 细胞系被广泛用于生产治疗性蛋白质，而最近通过基因编辑等新一代技术对 CHO 细胞进行工程改造的进展，使基因敲除细胞系的特性得到了增强。使用 CRISPR/Cas9 的基因组编辑系统通过 CRISPR 系统介导的双链断裂（double-strandbreak，DSB），在基因组的特定位点进行调控或基因敲除、基因敲入或整合感兴趣基因（gene-of-interest，GOI），在了解基因功能方面发挥了强大的作用。

　　在大分子生产的上游阶段，CLD 是一个漫长、耗时的过程，而且由于克隆的不稳定性和相关蛋白的可接受表达水平，CLD仍然具有挑战性。

　　产品变异性可在 CLD 过程的不同阶段产生，包括但不限于转染过程中的变异性、宿主细胞中基因整合的随机性（可导致克隆异质性）以及转基因的不稳定性和/或沉默。因此，稳定的克隆细胞库被用于 GMP 生产，以尽量减少最终产品的变异性。然而，随着目前的临床竞赛，越来越多的研究小组正努力在生产过程的早期实现产品质量的均一性，从而使临床前研究能够使用在 CLD 早期阶段生产的材料（即细胞池）。

　　基于转座子的技术

　　为了克服上述限制，人们利用称为转座子（transposons）的遗传元件作为载体，将 GOI 植入宿主基因组。转座子系统（ 如Sleeping Beauty、Leap-in、PiggyBac 和 Tol2）优先将 GOI 整合到活跃的转录位点上，使细胞系得以快速发展，并产生高滴度的重组蛋白。因此，转座子是将 GOI 运送到基因组中的理想载体。

　　DNA 转座子由转座酶基因和倒位末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）组成。转座酶的活性和转座子片段插入基因组位点是通过“剪切- 粘贴“机制进行的。利用转座子传递重组基因的基本载体设计包括 GOI 和选择标记，两侧是 ITR，转座子上的转座酶基因位于单独的载体上。不过，为了控制转座酶基因的活性，从而控制基因货物的流动性，转座酶通常以 mRNA 的形式提供。使用基于转座子的载体实际上消除了转座子载体骨架上存在的细菌元件整合的风险，因为转基因的整合是由转座酶催化的，它能特异性地识别 GOI 和选择盒侧翼的ITR。此外，这种表达系统提高了不同转染之间的可重复性，从而提高了克隆的稳定性。

　　基于转座子的技术和成熟的 CHO 细胞系已被采用于 CLD 和大分子表达工作流程中。基于转座子的表达系统可实现多拷贝、非片段化基因盒整合。这种转座子方法可使基因和表型水平上的克隆稳定性大于 95%，最大限度地减少了克隆筛选工作，从而简化了工艺开发并简化了规模化生产。

　　这种技术通常由两部分组成，即转座子载体和转座酶（最好是 mRNA 形式），两者可共同转染到 CHO 细胞系中。mRNA 翻译后，产生的转座酶催化转基因切除并整合到细胞系基因组中。与随机整合表达载体相比，转座子系统的一个优点是它允许表达盒在每个整合位点完整整合（图 1），因此不会出现任何片段化（图 2B）、重排（图 2C）或并合（图2D）。因此，将 GOI 定向整合到细胞系基因组内的转录活性位点，可使细胞系的同质性和克隆稳定性超过 95%。

　　未来展望

　　在过去的几十年中，大分子药物开发在上游和下游阶段都取得了进展，包括简化流程、建立关键质量属性 (CriticalQuality Attributes，CQA)、合规要求以及支持工作流程的技术。从生物学和技术角度来看，生产大分子药物的上游细胞系开发是一个关键和奠基性的步骤，它不仅有助于提高产品滴度产量和扩大规模，而且还确定了消除细胞伪影和最终纯化药物所需的技术。

　　如上所述，CHO 细胞系长期以来一直被广泛用于蛋白质药物的表达和生产。最近的基因编辑和 GOI 运送载体以及相关机制实现了有针对性的、一致的细胞系工程。

　　转座子技术提供了特定的启动平台，简化了开发过程，减少了生产工作量。通过自动细胞评估技术实现细胞计数和克隆选择方法的进一步发展和标准化，将进一步简化细胞培养过程中的端到端工作流程。将流程和协议与自动化、检测和细胞成像技术以及数据分析和管理相结合，将重新定义上游细胞系开发的流程。机器学习将进一步促进先进的预测和数据模型，以建立最佳实践并消除流程差距。跨各种功能和流程领域的组合协作方法将促成下一代生物制剂模型的精确性、可靠性和有效性。