细菌性食物中毒检测方法简析

　　蒙国伟

　　（防城港市疾病预防控制中心，广西防城港 538021）

　　摘　要：细菌性食物中毒是指因摄入食源性致病菌或其毒素污染的食品而引起的食物中毒，近几年，细菌性食物中毒在我国食物中毒事件报道中排第二位。在细菌性食物中毒事件中快速、准确地检出病原菌，是事件处置及患者救治的重要环节。本文就传统检测方法、免疫学方法以及分子生物学技术3 种常见的病原菌实验室检测技术进行简要分析，以供相关人员参考。

　　关键词：细菌性食物中毒；传统检测方法；免疫学方法；分子生物学技术

　　食品安全问题与人们的身体健康、生命安全，以及社会经济发展和社会稳定密切相关。食源性疾病的暴发会对人类健康和经济构成重大影响。据食源性疾病暴发监测系统统计，2020 年全国共报告食源性疾病7 073 起，导致37 454 例患病和143 人死亡。在确诊病因的4 662 起食源性疾病中，微生物病原体占食源性疾病暴发的41.7%[1]。在我国由细菌引起的食源性疾病中，沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌是最常见的细菌病原体。食源性病原体引发食物中毒后，要对暴发事件进行调查，进行病因确认、疾病控制、病原体监测。目前常见的微生物检测方法主要是传统检测方法、免疫学方法以及分子生物学技术。

　　1　传统检测方法

　　微生物传统检测方法常常要经过选择性增菌、分离培养、纯化培养、染色镜检、生化反应鉴定等步骤，被视为细菌检测的“金标准”，但是检测时间长，操作烦琐，通常需要2 ～ 5 d，检测效率低下，且对实验人员有较高的专业技能水平要求。随着检测技术的不断发展，以及对传统检测方法的改良，出现了许多以生化培养法为基础、酶底物显色法为原理的显色培养基、测试片、全自动微生物检测鉴定仪等产品。虽然微生物传统检测方法在不断改进，但在对不明原因中毒事件及难以培养或不可培养的病原体进行检测时，容易出现漏检的情况。

　　2　免疫学方法

　　2.1　酶联免疫法

　　酶联免疫吸附法，是利用酶标抗原（或抗体）以检测相对应的抗体（或抗原）的一种免疫学标记技术，通过底物被酶催化形成有色产物，进而根据颜色深浅来进行定性或定量测定[2]。陈靖等[3] 使用ELISA 法与SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法对同一批次的金黄色葡萄球菌肠毒素进行检测，通过对比发现两者检测结果一致，但ELISA 法的检测时间可缩短至4 h，表明ELISA 法在食物中毒检测方面具有高效性。在金黄色葡萄球菌肠毒素检测中，会使用较高纯度的肠毒素来制备特异性抗体，但肠毒素的纯化过程较为困难且设备昂贵，到目前为止，也仅有SEA ～ SEE、 SEG、SEH 和SelQ 抗体能够推广使用。且大部分的免疫学方法若直接应用于食物检测可能会产生不准确的结果[4]，同时，部分试剂因特异性比较低，在检测食品样本时会因食品成分的干扰出现假阳性结果。

　　2.2　免疫荧光法

　　免疫荧光技术是用荧光标记的抗原（或抗体）对细胞内的抗体（或抗原）进行定位，通过荧光显微镜或流式细胞仪等特定设备对细菌、病毒、细胞蛋白质等进行定性或定量测定[5]。温群文等[6] 使用Mini VIDAS 自动荧光免疫分析仪检测一起由沙门氏菌引起的食物中毒，45 min 即可得出结果。与传统检测方法相比，检测结果准确可靠，操作简单，可用于突发公共卫生事件中病原菌的快速筛查。

　　2.3　胶体金免疫层析法

　　免疫层析技术利用层析作用，标本（抗原）在移动过程中与已包被的抗体发生反应。如标本含有目标抗原则先与金标记抗体形成抗原抗体复合物，再与膜上包被的抗体形成双抗体夹心复合物，呈现目测可见的条带。该方法常用于腹泻患者的大便或海产品的霍乱弧菌和副溶血性弧菌检测。山珊等[7] 建立的级联信号转导系统结合免疫层析法在对大肠杆菌O157:H7 进行检测时，检测结果比传统的免疫层析法更为灵敏，灵敏度提高了570 倍。胶体金免疫层析法的优点是仅需少量标本即可在15 min 内通过肉眼观察到检测结果，突破了人员、场地的限制，检测时间短，操作方便，可用于突发公共卫生事件中的筛查。

　　3　分子生物学技术

　　分子生物学技术在鉴定难以培养及培养时间较长的细菌时发挥着重要的作用，为鉴定细菌提供了更加快速、准确的检测手段。常用的方法包括DNA 指纹图谱技术、核酸扩增技术、等温扩增技术、基因芯片技术和高通量测序技术。

　　3.1　DNA 指纹图谱技术

　　DNA 指纹图谱技术是基于DNA 序列的特异性和稳定性，通过分析DNA 中的特定区域或基因座上的多态性来识别个体之间的差异，其具有多位点、高变异性、简单而稳定遗传性的特点，可以用于食源性致病菌的鉴定、分型、变异等方面。王晓萌等[8] 对29 株S.sonnei 分离株与12 株肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7 分离株进行PFGE 分型，电泳图谱结果显示，4 起S. sonnei 引发的中毒事件中，同一起暴发事件的病原菌DNA 条带几乎一致；两起肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7 引起的食物中毒事件中，同一起暴发事件的病原菌DNA 条带几乎一致，只有3 株散发的有区别。脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）作为DNA 指纹图谱技术的一种，因其准确性、特异性、分辨率、重复性好，被视为细菌分子分型技术的金标准，被广泛地应用于病原微生物的分型；但是PFGE 操作方法虽然简单，但是步骤烦琐，耗时长，需要分离到纯菌株，且PFGE 仅能识别部分变异，无法具体体现菌株的基因突变情况。

　　3.2　核酸扩增技术

　　PCR 即聚合酶链式反应，经过重复循环变性、退火、延伸3 个基本反应步骤，每个循环2 ～ 4 min， 2 ～ 3 h 就能将目的基因扩增放大几百万倍，从而达到检测目的。PCR 技术是我国现行国标及行标中经常采用的检测技术之一。目前微生物检测最常用的有荧光PCR 技术和多重PCR 技术。宋耀丽[9] 采用国标法（传统培养法）与实时荧光定量PCR 法对30 份食物中毒患者肛拭子标本中的副溶血性弧菌进行直接检测，PCR 法比国标法的检出率高出近5 倍；增菌后实时荧光PCR 法与国标法阳性率一致。多重PCR 技术通过加入两种以上的特异性引物，可以同时对多种病原菌或毒力基因进行检测，蔡军等[10] 设计的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌3 种食源性致病菌快速检测试剂盒可检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌以及志贺氏菌；陈彬等[11] 建立的5 种金黄色葡萄球菌肠毒素快速检测试剂盒可快速检测金黄色葡萄球菌的SEA、SEB、SEC、SED、SEE。PCR 技术在食物中毒检测中比传统培养法有更高的敏感性和符合性，比传统培养法更节省时间，特别是多重 PCR 技术，在食物中事件中可以快速筛查出致病菌，为常规培养指明方向。

　　3.3　等温扩增技术

　　等温扩增技术是一种能在恒定温度下对核酸进扩增的分子生物学技术，目前常见的主流等温核酸扩增技术主要有以下5 种：滚环扩增、环介导等温扩增、链置换扩增、基于解旋酶的扩增及重组酶聚合酶扩增。与PCR 相比，等温扩增技术有以下优点：①程序简单、操作简便、设备要求低，不需要专用的热循环仪、水浴锅或恒温加热设备，结果判读多样化，包括比色、目视比浊、实时荧光定量等多种手段； ②特异度高，靶区域与引物不匹配则不能进行扩增； ③速度快，一般≤ 30 min；④灵敏度高，可检测飞克级靶标。吴家林等[12] 建立的副溶血性弧菌毒力基因tlh、tdh 环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），在检测模拟样本中， LAMP 法比PCR 法的灵敏度更高；在实际样本检测结果中，LAMP 法与国标法的检测结果一致，充分体现了副溶血性弧菌LAMP快速检测技术操作简单、快速、特异性强及灵敏度高等优点，具有较强的实际应用价值与良好的发展前景。目前等温扩增技术已广泛应用于病原微生物检测[13]。该方法的缺点是通量较低且引物设计难度大，试剂价格相对昂贵。

　　3.4　基因芯片技术

　　基因芯片是一种高通量分析技术，是核酸杂交衍生的一种方法，它可以快速、准确地检测和分析大量的生物分子信息。王小强等[14] 使用设计的基因芯片对96 份食物中毒样本和腹泻病人样本进行检测，发现基因芯片的检测结果与传统检测方法、荧光定量PCR 的检测结果一致。基因芯片具有高度的敏感性和特异性，有高信息量、快速、样品用量少、用途广泛等优点；相对的，基因芯片需要大量已知的、准确的DNA 和cDNA 片段的序列信息，芯片的制作和使用成本均较高，所以难以在一般的实验室中普及使用。

　　3.5　高通量测序技术

　　高通量测序技术经过最近十年的飞速发展，已从一代发展到三代，因其高覆盖度、高灵敏度以及高准确度等特点，已逐步代替常规的DNA 诊断和分子分型方法。高通量基因测序技术在食源性致病菌检测方面主要用于微生物种群分析、致病菌的分析与溯源、耐药基因分析和基因突变分析，以达到对食品安全风险的监测与预警，特别是在暴发的食品安全事件中，致病菌在难以通过临床诊断、难以培养、痕量等无法检测的情况下，更加突显高通量测序技术的重要性。相较于PFGE，全基因组测序更能完整地反映菌株的遗传和变异情况[15]。

　　3.6　质谱分析技术

　　微生物质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry， MALDI-TOF MS）是采用软电离技术，通过对微生物蛋白质中的特征谱峰进行鉴定和分类来区分细菌的属、种、株甚至是不同亚型，特别适合蛋白质等生物大分子的检测。徐志江等[16] 收集58 株非白喉棒状杆菌，用MALDI-TOF MS 和16S rRNA 基因测序两种方法进行鉴定和比较，结果发现，MALDI-TOF MS 可将棒状杆菌属细菌快速、准确地鉴定到种；龚艳清等[17] 用MALDI-TOF MS 对单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌和格氏李斯特菌5 种李斯特菌与VITEK 2 鉴定和荧光定量PCR 方法进行比较，结果发现，MALDI-TOF MS 能够快速、准确地区分上述5 种李斯特菌，在检测时间、准确度与重复性方面均优于普通生化鉴定。 MALDITOF-MS 技术适用于对李斯特菌等食源性病原菌进行高通量、低成本的快速鉴定。质谱技术检测具有操作步骤简单、程序自动化和结果准确率高的优点，能够有效地对微生物进行鉴定。在检测时间上更是缩短到了几分钟，突破了传统微生物生化鉴定操作复杂、周期长、效率低的短板。

　　4　结语

　　细菌性食物中毒事件中，影响检测结果质量的因素很多，包括样本的采集、运送、检测人员的技术水平、检测方法的选择、培养基及试剂效能、仪器的准确度等。在确保样本合格的条件下，结合临床症状和流行病调查结果，应尽量使用多种检测方法联合检测， 如运用荧光定量PCR、FilmArrayTM 多重PCR 系统、MPS 多重致病菌核酸检测系统、 MiniVIDAS 自动荧光免疫分析仪或胶体金免疫层析技术等快速筛查病原菌，为常规分离培养找出方向；利用微生物质谱对可疑菌落进行快速鉴定的同时也做常规生化鉴定；利用脉冲场凝胶电泳或全基因组测序对病原菌进行溯源，并对病原菌的遗传变异特征和耐药基因进行分析；在某些情况下，还可以通过宏基因组测序技术对未知或难以判断的食物中毒和感染进行检测等，通过多种方法、多种检测手段联合检测，从而确保结果的快速、准确。

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