PCR 技术在食品微生物检测中的应用研究进展

来源:食品安全导刊
关键字:PCR 技术,食品微生物检测,应用
发布时间:2024-10-30 12:07

　　银菊香

　　（武威市疾病预防控制中心，甘肃武威 733000）

　　摘　要：食品中的微生物污染是影响食品安全的重要因素之一。聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction，PCR）技术具有灵敏、快速等特点，属于一种特异检测方法，被广泛应用于食品微生物检测。本文阐述PCR 技术的特点及其在食品微生物检测中的应用，探讨当前PCR 技术在食品微生物检测中存在的主要问题，以期为PCR 技术在食品微生物检测领域中的应用提供借鉴。

　　关键词：PCR 技术；食品微生物检测；应用

　　食品作为人们生存和发展的重要物质基础，事关人们的身体健康及生命安全，而微生物污染是食源性疾病的重要原因之一。因此，对食品开展快速、准确的微生物检测至关重要。传统的微生物检测方法如培养法、生化鉴定法等，虽然具有一定的准确性，但存在检测周期长、操作烦琐、灵敏度低等缺点[1]。PCR 是一种分子生物学技术，具有灵敏、快速等特点，被广泛应用于食品微生物检测。

　　1　PCR 技术的特点

　　1.1　高灵敏度

　　PCR 技术能对极微量的微生物DNA 进行检测和分析，可将皮克量级扩增到微克水平，能够从大量的食品样本中检测出痕量的特定微生物，这对于检测那些含量极低但可能对食品安全构成威胁的微生物极其重要[2]。

　　1.2　高特异性

　　PCR 技术遵循碱基配对原则，以引物与模板DNA 特异性结合、Taq 聚合酶合成反应及靶基因的保守性与特异性为基准，特异性强，碱基错配率低。PCR 技术通过选择特异性的引物，能精准地扩增目标微生物的特定DNA 片段，从而准确识别出目标微生物，有效避免对其他非目标微生物的误检[3]。

　　1.3　快速且简便

　　PCR 技术操作相对简便，只需要一次性将反应液加好后，就可以进行扩增，一般在数小时（通常2 ～ 4 h）内完成扩增反应，与传统的微生物培养检测方法相比，大大缩短了检测时间，能够及时为食品生产、加工、流通等环节提供检测结果，有助于快速采取相应的措施。

　　1.4　对样品要求较低且重现性较好

　　PCR 技术不需要对微生物进行分离培养等复杂的前处理步骤，DNA 粗制品及RNA 均可作为扩增模板，能够适应各种不同类型的食品样本。同时，只要严格控制实验条件，如温度、反应时间、试剂浓度等，PCR 反应具有较好的重现性，能够保证实验结果的稳定性和可靠性，这对于大规模的食品微生物检测以及不同实验室之间结果的比较和验证非常重要。

　　1.5　可实现定量检测

　　实时荧光定量PCR 技术等可以对微生物的DNA进行定量分析，能够确定食品中微生物的数量，为评估食品微生物污染的程度提供更精确的数据，对于判断食品的安全性和质量具有重要意义[4]。

　　1.6　适用范围较广，可同时检测多种微生物

　　PCR 技术可检测多种食品中的微生物，如细菌、病毒、真菌等，并且针对不同的微生物可以设计相应的引物进行特异性检测。此外，借助多重PCR技术，将多对引物加入同一反应体系，可以扩增出多条微生物核酸片段，实现多种目标微生物的同时检测，节省了时间，降低了成本，提高了检测效率。

　　2　PCR 技术在食品微生物检测中的应用

　　2.1　细菌检测

　　食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因之一，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，而PCR 技术可以快速、准确地检测这些致病菌，为食品安全监管提供了有力的技术支持。艾鹏飞等[5] 针对传统食源性细菌检测方法实验步骤复杂、实验周期较长、灵敏度较低等问题，以单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7、蜡样芽孢杆菌为研究对象，通过实验成功建立了同时检测以上3 种细菌的TaqMan 多重实时定量PCR 方法。该方法通过对单增李斯特菌mpl 基因、大肠杆菌O157:H7 tir 基因、蜡样芽孢杆菌entFM 基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan 探针，并在建立的多重qPCR 反应体系下，实现对3 种细菌的特异性检测，最低检出限可低至12 CFU·mL-1，阳性检出率为100%，检测周期为6 h，可实现大批量样品快速检测。刘艳等[6] 针对包装饮用水中铜绿假单胞菌检测周期长、准确性较低等问题，建立了针对包装饮用水中铜绿假单胞菌快速定量检测的ddPCR方法。该方法的检出限为10 CFU·mL-1，灵敏度较好，能够满足包装饮用水中铜绿假单胞菌的实际检测需求。

　　2.2　病毒检测

　　一些病毒如诺如病毒、甲型肝炎病毒等，具有高度传染性、快速传播性等特点，能够通过食品、水等媒介对人们的健康造成严重危害。利用PCR 技术可快速、准确检测这些致病性病毒，为食品安全监管、疾病防控提供重要的技术支持。陈波等[7] 成功建立了检测诺如病毒的TaqMan 荧光定量PCR 方法。研究结果显示，40 min 内即可得到检测结果，方法的灵敏度较高，最低检测限为1.2 copies·μL-1，可实现对于低浓度样品的准确检测，避免了假阴性样品的出现。经数字PCR 实验验证后进一步表明该方法的可行性和科学性，为准确检测诺如病毒及流行病学监测提供了有效的技术支持。严礼等[8]为准确、快速地检测猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒，针对非洲猪瘟病毒核酸的VP72 和K205 基因设计并合成3 对引物及探针，通过优化反应条件，最终建立了非洲猪瘟病毒微滴数字PCR 的检测方法。该方法可有效减少与猪肉中其他病毒发生交叉反应，具有较高的特异性，有助于在猪肉及其肉制品加工生产过程中及时发现非洲猪瘟病毒，防范食品安全风险。

　　2.3　真菌检测

　　食品中存在的产毒真菌，一旦被人体摄入，可能会引起急性中毒反应。同时，长期低剂量摄入产毒真菌污染的食物，可导致慢性中毒，会对人体多个器官系统造成损害，尤其是肝脏和肾脏。因此，加强食品中真菌检测，对于有效预防急性和慢性中毒事件发生十分必要。冯优妍等[9] 为了实现快速检测粮食中的主要霉菌（寄生曲霉、黄曲霉），通过设计TaqMan® 实时荧光PCR 反应引物及探针，对RTPCR反应体系进行优化，建立了粮食中黄曲霉、寄生曲霉的RT-PCR 检测方法。此方法具有较强的特异性，且通过10 种霉菌模拟污染粮食模型验证，无假阳性现象出现；最低检测浓度可低至0.01 ng·μL-1，灵敏度高于普通PCR 方法，可应用于早期粮食霉变筛查，有效防止霉变粮食大面积污染，为保障我国粮食质量安全提供了技术支撑。张庆等[10] 使用多重实时荧光PCR 方法，建立了4 种产毒真菌检测体系，可在2 h 内进行快速检测，对青霉的最低检出限为1.53×104 拷贝/ 反应，对产黄曲霉毒素的最低检出限为3.37×104 拷贝/ 反应，对镰刀菌的最低检出限为3.95×104 拷贝/ 反应，对赭曲霉的最低检出限为1.91×104 拷贝/ 反应。该方法具有高灵敏度和强特异性的特点，可满足大批量检测需求，为及时发现食品中此类产毒真菌的存在提供了鉴别方法。

　　3　当前PCR 技术在食品微生物检测中存在的主要问题

　　3.1　假阳性问题

　　3.1.1　污染导致假阳性

　　在PCR 检测过程中，极微量的污染就可能导致假阳性结果，如实验室环境中的气溶胶污染、操作过程中样本间的交叉污染等。如果实验室的通风系统不完善，或者操作人员未能严格遵守操作规程，则容易使空气中的污染物进入反应体系，从而产生假阳性现象。同时，试剂污染也是常见的导致假阳性结果的原因之一。PCR 试剂中的各种成分，如引物、酶等，如果在生产或储存过程中受到污染，也可能在检测中引入外源DNA，进而导致出现假阳性现象。

　　3.1.2　引物设计不合理导致假阳性

　　引物的特异性较低也是产生假阳性的重要因素之一。如果引物与非目标微生物的DNA 序列有一定相似性，就可能在PCR 反应中扩增出非目标产物，造成假阳性。例如，在设计引物时，如果没有充分考虑到食品中可能存在的其他微生物的基因组序列，易导致出现假阳性现象。

　　3.2　假阴性问题

　　3.2.1　样本中抑制物的存在

　　食品样本中可能存在各种抑制PCR 反应的物质，如多糖、蛋白质、酚类和重金属离子等。这些抑制物可能与PCR 反应中的酶、引物或模板DNA 结合，从而影响PCR 反应的进行，导致出现假阴性结果。此外，不同的食品基质对PCR 的抑制程度也不同。例如，肉类、奶制品等高蛋白食品中的蛋白质可能会与酶结合，抑制酶的活性；而植物性食品中的多糖可能会干扰DNA 的提取和纯化过程。

　　3.2.2　目标微生物数量过少

　　如果食品中的目标微生物数量极少，可能低于PCR 检测灵敏度的下限，从而导致假阴性结果。在实际检测中，由于食品加工、储存等过程中目标微生物在食品中分布不均匀，可能使检测结果出现假阴性。

　　3.3　定量问题

　　PCR 技术虽然可以实现对目的DNA 片段的扩增，但不能直接对微生物的数量进行定量。目前，常用的定量方法如实时荧光定量PCR 技术虽然可实现对微生物的相对定量，但仍然存在一定程度的误差。

　　3.4　技术要求高

　　PCR技术需要专业的设备和技术人员进行操作。操作人员需经过专业培训，熟悉PCR 反应的原理、操作步骤和注意事项，否则容易出现操作失误，影响检测结果的准确性。例如，在DNA 提取、引物设计、反应条件优化等环节，都需要一定的专业知识和技能。此外，PCR 技术对实验室环境的要求相对较高。PCR 实验室需严格分区，避免交叉污染。同时，实验室的温度、湿度等环境条件也需严格控制，以确保PCR 反应的稳定性和重复性[11]。

　　3.5　成本较高

　　PCR 检测需要使用昂贵的仪器设备和试剂，如PCR 仪、凝胶成像系统、引物、酶等。这些设备和试剂的成本相对较高，因此PCR 检测费用较普通检测方法也较高，造成该技术未能全面得到应用。

　　4　结语

　　随着分子生物技术的持续发展，PCR 技术在食品微生物检测中的应用前景十分广泛。未来，研究人员还应加快优化PCR 技术，提高食品微生物检测的科学性、准确性、规范性，降低成本，提高效率，为食品安全监管提供技术保障。

　　参考文献

　　[1] 邓小燕. 食品微生物检验内容及检测技术分析[J].工业微生物,2024,54(2):179-181.

　　[2] 巩莉, 刘秀红. 食品微生物检测中PCR 技术的应用[J]. 中国食品工业,2024(5):83-85.

　　[3] 石思文. 浅析PCR 技术在食品微生物检测中的应用[J]. 中国食品工业,2023(22):72-74.

　　[4] 薛磊.PCR 技术及其在食品微生物检测中的运用策略[J]. 现代食品,2023,29(2):136-138.

　　[5] 艾鹏飞, 王珊, 高辉明, 等.TaqMan 多重实时定量PCR 快速检测3 种常见食源性病原菌[J]. 中国食品学报,2024,24(5):373-380.

　　[6] 刘艳, 李诗瑶, 张伊动, 等. 微滴式数字PCR定量检测包装饮用水中铜绿假单胞菌[J]. 中南农业科技,2024,45(8):55-58.

　　[7] 陈波, 李家奇, 付立申, 等. 诺如病毒TaqMan 荧光定量PCR 检测方法的设计与优化[J]. 五邑大学学报( 自然科学版),2024,38(3):1-6.