用小分子靶向 RNA

　　RNA 药物靶点有可能彻底改变几乎所有疾病的治疗格局。除了 mRNA 作为基因表达中间体的角色外，非编码 RNA 在转录调控、成熟和翻译中也发挥着至关重要的作用。这篇文章简要探讨了 RNA 作为临床验证的药物开发途径的潜力、设计和发现方法以及对未来医学的影响。

　　传统的药物开发主要以蛋白质为靶点，目标通常是增强或抑制蛋白质的活性。通常情况下，蛋白质药物靶点表达不足或过度表达，靶向问题蛋白质并不一定能解决根本原因。这是许多间接改变靶点表达水平的治疗药物潜伏期明显延长的原因，如离子通道和神经递质受体；以及为什么超过一半的蛋白质药物靶标本身是直接或间接的转录调节因子，例如核受体，激酶和 G 蛋白偶联受体。 同样，microRNA 等非编码 RNA 也是具有潜在深远治疗效果的绝佳靶点，因为它们能同时调节多种功能相关转录本的表达水平，提供了一种天生的组合治疗途径。这种多特异性可能是喜忧参半的，因为非靶点可能是禁忌、致癌或致命的。因此，在选择靶点时，建议进行全面的生物信息学分析，即使该靶点已在临床前研究中得到证实。

　　RNA 在溶液中的短暂性大大延缓了新的 RNA 靶向疗法的出现。此外，成熟的早期蛋白质靶点药物发现方法通常与 RNA 靶点不兼容。计算方法落后于蛋白质靶点的同类方法数十年，高通量靶点接合研究很难转化为理想的生物活性，DNA 编码文库尤其不适用，组合化学文库通常也不合适——每个核苷酸除了脆性磷酸二酯键外，还表现出多个反应中心，远不如有序蛋白质靶点那样受三级结构的保护。新出现的 RNA 靶向药物都是独立于靶点的表型筛选或功能生化筛选的成果。随着计算机辅助药物设计技术的发展，将迎来定制 RNA 靶向药物设计时代。

　　选择性地靶向 RNA 分子，就有可能在基因表达的早期阶段进行化学干预，从而影响蛋白质的生成，并最终影响疾病的进展。靶向 RNA 的能力为开发疗法提供了可能性，这些疗法可针对以前被认为具有挑战性或无法治疗的靶点。

　　为什么是小分子？

　　使用 RNA 分子作为治疗药物来靶向 RNA 失衡是比较简单的——过表达的靶点可以用互补寡核苷酸来敲除，表达不足的靶点可以用转录本自身来补充。根据 InformaPLC 和 Beacon Capital 报告的2022 年市场细分估值，尽管寡核苷酸在临床批准的市场份额中占比不到 0.5%，但与小分子相比，这种简便性使寡核苷酸治疗途径获得了 97%的开发资金分配。迄今为止，已有 18 种寡核苷酸疗法获批用于治疗各种疾病，包括精心设计的剪接开关和蛋白适配体。由于 RNA 干扰在构思、合成和早期评估方面相对容易，因此 RNA 作为药物和靶点都很有吸引力——RNA 干扰经常在临床前显示出治疗疾病的前景。然而，要使非翻译寡核苷酸疗法成熟并应用于临床，还存在一些主要障碍。

　　1. 生物利用率： 即使是很小的寡核苷酸，其体积和极性也要大几个数量级，无法在没有辅助的情况下通过细胞膜到达靶点。此外，RNA 很容易被大多数生物体内普遍存在的 RNA 酶降解。目前先进的给药载体，如脂质纳米粒子，可以进入注射部位或肝脏的局部靶点，而且其发展将继续扩大进入更多生理分区的机会。然而，给药方式仅限于注射，严重限制了长期治疗或个性化剂量方案的可行性。

　　2. 竞争： 与受益于转化生物放大的 mRNA 疫苗不同，抑制性寡核苷酸的作用机制受限于其过表达靶点的浓度——它与所有其他本地 RNA 分子直接竞争进入 AGO2。DICER 会自然地促进 RISC 组装，使新鲜成熟的 miR 与AGO2 对接。异生物抑制性寡核苷酸对 AGO2 的亲和力往往低于其互补 RNA 靶标，这意味着靶标诱导异生物寡核苷酸裂解的效率要高于异生物对靶标的作用。这就导致剂量过大，加剧了固有毒性。

　　3. 毒性： 如果要唤起免疫反应或靶向肿瘤，毒性可能是一个有益的特征。即便如此，这也是一种微妙的平衡。

　　4. 特异性： 寡核苷酸很少具有单核苷酸分辨率的特异性。此外，生物物理特性和 RNA 作用蛋白的脱靶效应也不可避免。

　　5. 通用性： 与任何生物制剂一样，任何寡核苷酸的市场份额都很容易被生物仿制药或者没有寡核苷酸相关注意事项的小分子药物效仿并取代。

　　小分子的设计可以减少所有以上这些障碍，提高治疗RNA 靶点的精确性、生物利用度和整体安全性。

　　临床应用中的 RNA 靶向小分子

　　下面将介绍所有四类临床批准的 RNA 靶点及其发现过程。值得注意的是，所有这些药物都以与蛋白质形成生物复合物的非编码调控 RNA 为靶标，目前获批的 40 多种分子都具有极性和其他理化特性，达到或超过了传统药物的标准。

　　1. 抗生素

　　原核生物 70S 核糖体是一个神奇的抗生素药物靶点，它是所有生物功能不可或缺的保守基石。历史悠久的细菌培养技术本质上是一种低成本、高通量的表型检测方法，适用于任何抗生素靶点。1944 年，链霉素被发现后不到一年就被批准用于临床。这是美国食品及药物管理局批准的第一种 RNA 作用药物，尽管当时还不知道这一点。结合30S 核糖体亚基的 A 位点以干扰翻译保真度的作用机制的解密工作在 20 多年后才真正开始。

　　诺贝尔奖获得者对大于 4.3 兆道尔顿的 70S 核糖体进行了结晶和后续结构测定，阐明了具有不同作用机制的多个抗生素结合位点。这些结构数据促进了完全合成的 70S结构引导的抗生素设计，并提供了首个经临床验证的结构数据，这对训练智能药物设计算法至关重要。

　　2. 化学疗法

　　从天然产物体外筛选中发现的 80S 核糖体 A 位点伸长阻断机制以及omacetaxine mepesuccinate（高三尖杉酯碱）的抗肿瘤特性，分别比结构阐明和临床批准用于激酶抑制剂耐药白血病的时间早 35 年和 37 年。有人认为，omacetaxine mepesuccinate 的主要靶标可能不是最初描述的 80S 真核核糖体，而是线粒体 55S 核糖体。

　　哺乳动物线粒体 55S 核糖体仅翻译 13 种蛋白质，其三种线粒体 rRNA 由核糖体基因组编码。与 99% 的线粒体蛋白一样，核糖体蛋白成分也由核基因组编码。线粒体核糖体交叉反应被认为是 A 位点靶向抗生素的潜在化疗机制。迄今为止，尚未批准将具有 55S 交叉反应性的抗生素重新定位为化疗药物。

　　3. 无义逃避

　　包括杜兴氏肌肉萎缩症和囊性纤维化在内的许多遗传疾病都是由于无义突变引起的。这些突变引入了过早的终止密码子，编码出截短、无功能的蛋白质。PTCTherapeutics 公司开发了表型筛选，以确定患者来源的生物发光报告细胞系中的蛋白质表达救援。Ataluren 是一种假阳性、被误认为是荧光素酶稳定剂。与链霉素类似，Ataluren 可能与核糖体的 A 位点结合，干扰翻译的保真度，但只干扰过早终止密码子，排除真核释放因子，使全长蛋白质的合成逃脱。

　　4. 剪接修饰

　　脊髓性肌萎缩症（SMA）是导致婴幼儿死亡的主要遗传病因。SMN1 突变编码低功能或无功能的存活运动神经元蛋白，导致运动神经元变性、肌肉无力，严重时导致死亡。然而，SMN 蛋白在病理上仍然表达不足，部分原因是SMN2 的替代剪接排除了第 7 号外显子，从而产生了截短的、无功能的蛋白。2020 年美国食品及药物管理局批准的Risdiplam 可改变 SMN2 的剪接，促进全长 mRNA 的产生，从而缓解相关临床症状。

　　通过使用人类胚胎肾细胞 SMN2 生物发光报告基因进行高通量筛选，发现了 Risdiplam 前体。通过在 SMA 患者来源的成纤维细胞培养物中的全长 SMA 转录本表达，以及在患者来源的 iPSC（诱导多能干细胞）产生的运动神经元培养物中的蛋白表达，对找到的前体进行了进一步评估。虽然在结构上尚未解决，但其机制似乎不仅涉及 SMN2mRNA 结合，还涉及 U1 剪接体 RNA 及其相关小核核糖核蛋白的直接参与。

　　Risdiplam 不仅作为一种非核糖体 RNA 靶向治疗药物，而且作为一种小分子寡核苷酸治疗置换的首次展示，都是一流的。Nusinersen 是一种旨在纠正 SMN2 剪接变异的反义寡核苷酸，已于 2016 年获批用于临床。 最重要的是，risdiplam与更长的存活期和更多的运动功能增益相关，而且是口服给药而不是鞘内给药，报告的副作用也要轻得多。

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