人羊膜间充质干细胞治疗急性心肌梗死的研究进展

　　【摘要】人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）因其具有自我更新、向不同组织分化及免疫调节功能，因而被认为是治疗急性心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的最有效的方法之一。本文主要概述hAMSCs的生物学及免疫学特性和急性心肌梗死后的免疫炎症反应，以及人羊膜间充质干细胞通过不同移植方式治疗急性心肌梗死的原理和机制，并阐述其改善心功能的可能性及目前存在的问题。

　　【关键词】人羊膜间充质干细胞；急性心肌梗死；干细胞治疗；临床前研究

　　心肌梗死（myocardial infarction，MI）是导致死亡的主要疾病之一。当发生急性心肌梗死时，由于成熟心肌细胞的增殖、分裂能力有限，所以心肌细胞数量减少，残存心肌细胞代偿性肥大，心室重构，心功能下降[1]，并继以瘢痕组织形成，从而严重影响了心脏的收缩及舒张功能，长期的过程导致慢性心力衰竭。传统的药物、冠脉介入及手术治疗仅能有限的缓解症状而不能从根源上解决心肌细胞的缺失的问题，心肌梗死后心衰的发生率及死亡率仍不断升高。随着干细胞技术的发展，基于干细胞移植的细胞心肌成形术（cellular cardiomyoplasty，CCM）已成为治疗MI的研究热点。近年来，人羊膜间充质细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）的可塑性研究引人注目。已有研究表明，hAMSCs能够表达胚胎干细胞的某些表面标志，具有分化为心肌细胞的潜能，但是其移植方式和治疗急性心肌梗死机制报道较少，结论未知，因此本文探讨人羊膜间充质干细胞在急性心肌梗死患者中的应用，阐明原理和机制，为临床合理使用提供理论依据。

　　1 人羊膜间充质干细胞的定义、不可替代性及多向分化潜能

　　1.1 人羊膜间充质干细胞的定义

　　人羊膜间充质干细胞是一类具有自我更新、多向分化潜能的干细胞，主要由来源于外胚层的上皮细胞和来源于中胚层的间充质细胞构成。目前国际细胞治疗协会将其定义为培养过程中具有贴壁能力；表达表面抗原CD73、CD90和CD105，不表达CD34、CD45、HLA-DR、CD14或CD11b、CD79a；在体外可以向骨、软骨、脂肪组织等分化。

　　1.2 人羊膜间充质干细胞的不可替代性

　　在传统细胞治疗中，常采用骨髓间充质干细胞在特定的机体外化环境下，诱导分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种组织细胞，从而作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官的损伤修复。人羊膜间充质干细胞可从分娩后废弃的胎盘中获得，具有获取简单、几乎不受伦理学限制、免疫原性低，具有干细胞的共性，能够自我更新、多向分化和归巢的能力成为细胞移植的新来源。另外有研究表明，培养3～4周后得到大量的贴壁间人羊膜充质干细胞，形态学类似于骨髓间充质干细胞，且其比骨髓来源的MSCs具有更强的增殖能力，在体外至少可以传到第15代而保持其形态不变。大量的试验研究也证实了hAMSCs比骨髓间充质干细胞有更强的增殖分化能力及干细胞特性。

　　1.3 人羊膜间充质干细胞的多向分化潜能

　　研究表明，在体外适当的诱导条件下，hAMSCs具有向3个胚层的不同组织细胞类型分化的潜能。hAMSCs能够分化为：神经细胞（外胚层）；成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞（中胚层）；肝样细胞、胰岛样细胞[2]（内胚层）。在向心肌细胞分化中，Dai研究证明了5-氮杂胞苷对间充质干细胞向心肌分化的诱导作用，并提出了适宜的诱导条件是在细胞接种后3d内用浓度为5-10μmol/L的5-氮杂胞苷持续作用24h。诱导的心肌细胞可以表达α-肌动蛋白、cTnT、Nkx2.5及GATA-4，并有一些细胞出现自发性跳动，与心肌细胞的直接接触是诱导间充质干细胞分化为心肌细胞的必需条件。已有实验证明移植后6周大鼠MI区人细胞系特异性抗原阳性细胞表达CX-43、α-辅肌动蛋白和结蛋白，说明经静脉移植的hAMSCs在病损心肌组织可分化成心肌细胞。

　　2 急性心肌梗死后免疫炎症反应

　　心肌梗死后受累心肌组织的修复经历三个阶段：首先，心肌细胞因缺血缺氧而发生坏死，死亡的心肌细胞表达细胞因子、趋化因子与黏附分子，导致中性粒细胞向坏死区趋化浸润，此为炎症期（心肌梗死后3d）；之后，随着死亡细胞的清除，抑制炎症反应的信号被启动，同时成纤维细胞增殖分化为肌成纤维细胞，成纤维细胞分泌大量细胞外基质而进入增殖期（心肌梗死后7d）；最后，因细胞外基质沉积于梗死区，从而形成稳定的瘢痕组织，称为成熟期。

　　2.1 急性心肌梗死后免疫炎症反应的激活

　　（1）补体系统激活：心肌细胞坏死后，细胞内成分外泄可以激活C1、C2、C3和C4等补体成份，诱发补体级联反应，激活系统炎症反应，从而增加血管通透性、介导中性粒细胞和单核细胞向梗死部位趋化，清除坏死心肌组织。

　　（2）核因子-κB激活：NF-κB的刺激信号极其广泛，有IL-1、TNF-α以及内毒素、脂多糖、磷脂酶A、溶血磷脂酰胆碱、氧化应激代谢产物、病毒、缺血-再灌注等，AMI后在刺激因子作用下，与IκB解离而活化，并迅速核移位，与特异性κB结合而启动靶基因转录，分泌IL、TNF、细胞黏附分子、干扰素等炎性介质，产生急性炎症反应。

　　（3）活性氧族的激活：心肌梗死后损伤局部将产生大量的活性氧族（ROS），它可以直接损伤心肌细胞和血管细胞，通过诱导细胞因子的表达激发炎症级联反应。

　　2.2 免疫炎症反应在急性心肌梗死修复过程中的作用

　　炎性细胞因子能够清除梗死部位坏死组织，心肌梗死后，中性粒细胞、单核细胞等迁移至梗死局部参与损伤修复，同时NF-κB炎症信号通路被激活，迁移至损伤部位的炎性细胞表达和分泌大量的炎性细胞因子，而炎性细胞因子又可以反过来激活NF-κB炎症信号通路，进一步增加局部炎性细胞因子、趋化因子等的表达。AMI后炎性细胞因子如TNF-α和IL-6能上调并激活MMPs，即调控胶原的降解，最终影响基质的沉积。炎性细胞在参与损伤修复的过程中必须分泌MMPs降解梗死部位的细胞外基质，才能浸润至损伤处。

　　3 移植方式

　　将人羊膜间充质干细胞输入心脏移植的途径有很多，目前主要的移植方法有心肌内直接注射、经皮穿刺导管介入心内膜注射、冠状动脉内移植和静脉注射和4种。

　　3.1 心肌内直接注射法

　　在直视心脏的情况下，直接将细胞注射到功能细胞缺失的心外膜下区域，这种方式需开胸手术，技术难度及创伤较大，定位准确，并且当发生穿孔时，可以进行修补。Schuleri等于猪缺血性心肌病12周后分别接受俩种不同剂量（20×106和200×106）的间充质干细胞，不同剂量组的心肌酶无明显区别，但大剂量组的心梗面积较小剂量组明显下降，而且梗死局部心肌的收缩力也较小剂量组明显提高。

　　3.2 经皮穿刺导管介入心内膜注射

　　该法可均匀地将干细胞移植到心肌缺血区域和周边区域心内膜下，属于微创操作，但是技术难度大，易致心律失常.研究证明经心内膜直接注射人羊膜间充质干细胞及重组质粒后1年，可显著增加缺血心肌部位毛细血管的数量，从而改善缺血区的血流灌注，促进局部细胞结构的恢复，改善局部的机械特性，从而改善心功能。

　　3.3 冠状动脉内移植法

　　冠脉造影采用标准的Judins法或经桡动脉径路，从股动脉或桡动脉穿刺插管，用普通冠状动脉导管放置于冠状动脉开口处，直接注入hAMSCS，左冠脉注入2/3，右冠脉注入1/3。总剂量不少于3×108个/10ml，细胞活度≥95%。此法因其暂时阻断冠脉血流，可能使干细胞无法有效到达梗死区域并导致室颤等严重并发症。

　　3.4 静脉注射

　　是最简单的方法，具有损伤小，操作简单，易于为患者接受等特点，但这种方法在很大程度上依赖于干细胞的归巢，经静脉移植的骨髓间充质干细胞很可能被其他器官阻留，只有很少的一部分移植细胞能到达心肌梗死区，该法必须途径肺循环，这使得必须考虑到经过血液循环进入心脏的干细胞是否会下降而影响间充质干细胞向心肌细胞的分化。

　　4 干细胞作用机制

　　4.1 促进血管再生

　　已有研究表明干细胞移植促进梗死部位及周边区域的血管再生，Tang等自体间充质干细胞移植后，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞因子表达均较对照组明显增高，移植后2周，新生毛细血管血管密度超过对照组约40%。干细胞自分泌或旁分泌血管内皮生长因子VEGF，增加毛细血管壁通透性，激活基质降解金属蛋白酶，促进内皮细胞的增殖和迁移，是最重要的促血管生成因子。

　　4.2 抗凋亡作用

　　间充质干细胞心肌移植可促进心肌梗死区Bcl-2蛋白表达，并减轻大鼠心肌梗死后细胞凋亡，其机制可能与对Bcl-2表达的调节有关。Bcl-2和C-myc可协同封闭P53进入核中，以阻断P53诱导的细胞凋亡和生长停止。Bcl-2也可以和Bax结合，拮抗Bax的促凋亡作用。研究发现，MSCs移植术后4周移植组大鼠Fas、FasL蛋白水平下调，故认为同种异体MSCs移植对心肌梗死后心肌细胞凋亡有明显的抑制作用。可能机制是通过上调Bcl-2基因表达并抑制Fas、FasL基因表达，减少心肌细胞凋亡的发生，从而达到保护心肌、改善AMI后心脏功能的作用。

　　4.3 趋化作用

　　hAMSC治疗有利于心肌梗死后心肌修复，干细胞因子/Kit对CD34干细胞的趋化作用尤为重要。hAMSC能够分化为成熟的血管内皮细胞并促进受损内皮修复，因此成为修补缺血组织的目标。诱导内源性c-kit+心肌细胞的增殖，也可通过激活或促进其他细胞向心脏归巢、再生为心肌细胞而发挥作用。

　　5 总结和展望

　　早期临床研究已初步证实经冠状动脉内注入骨髓来源干细胞来治疗AMI及慢性心肌缺血患者的安全性及有效性，但这种移植方式限制了大规模随机双盲临床试验的进行。对于已经形成瘢痕组织的心衰患者，骨骼肌成肌细胞及CDCs治疗的有效性也得到初步验证[3]。鉴于人羊膜间充质干细胞取材简易，增殖和分化能力强，生物特性明显优于骨髓来源细胞，是一种能够替代骨髓来源细胞治疗急性心肌梗死的理想种子。虽然大量研究证明了干细胞移植可以改善心肌梗死后心衰的心功能，但仍有许多问题需要解决。由于急性心肌梗死后细胞移植的最佳时间和细胞数量仍不清楚，致使部分患者错失了最佳治疗时机，并且再灌注时间、再灌注方式、梗死面积、基础心功能、干细胞数量和生物特性等都会对移植时间产生影响。移植细胞的数量及移植细胞在心梗边缘区的存活率是治疗心梗效果的关键因素之一。此外，由于人羊膜间充质干细胞的致瘤性，易导致潜在的致心律失常。总而言之，人羊膜间充质干细胞移植作为一项新的技术，以其特有的生物学特性及大量的临床试验为治疗急性心肌梗死患者提供了广阔的前景。

　　参考文献

　　[1]陈荟竹，郭应坤，宁刚.间充质干细胞移植治疗心肌梗死的研究进展[J].生物医学工程学杂志，2014(04)：31.

　　[2]陈婷，陈光辉.间充质干细胞移植治疗心血管疾病的应用与进展[J].中国组织工程研究，2013(01)：17.

　　[3]高青，李树仁.基因修饰干细胞治疗心肌梗死：临床前和临床应用中的相关问题[J].中国组织工程研究，2014(18)：32.

　　艾坤

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