聚焦世华虾蟹会：科研家未交“白卷”，逼近虾病真相

　　12月6日-8日在湛江举行的第九届世界华人虾蟹养殖研讨会，就养殖技术与环境、水产基础生物学、病害与免疫和遗传育种、营养与生理和食品安全及其它等四个会场进行分组报告，共110场报告，成果纷呈。

　　虾病的肆掠，让养虾业者心头蒙上阴霾，养殖市场悲观的情绪给科研工作者们莫大的心理压力。所幸的是，12月6日-8日在湛江举行的第九届世界华人虾蟹养殖研讨会（简称“世华虾蟹会”）上，科研工作者们没有向业者提交“白卷”，成果纷呈。

　　本届世华虾蟹会由中国海洋湖沼学会、中国动物学会甲壳动物学分会主办，广东海洋大学、广东恒兴饲料实业股份有限公司联合承办，湛江海茂水产生物科技有限公司、广州信豚水产技术有限公司、《水产前沿》协办，吸引了超600名业者前来参会，说明业者内心始终对虾充满希望。

　　世华虾蟹会每两年举办一次，可以说凭借着其优质的论文和前沿的观点而受到全球虾、蟹业界人士的广泛关注，这是属于全球华人的国际性系列会议，每一次举办都能够促进中国虾蟹养殖的跨越式发展。经过17年来的发展和推广，世华虾蟹会已经成为在中国本土召开的规模大、层次高、影响较大的有关虾蟹养殖的综合性国际盛会。据了解，第十届世华虾蟹会将于2016年由上海海洋大学承办。

　　本次研讨会就养殖技术与环境、水产基础生物学、病害与免疫和遗传育种、营养与生理和食品安全及其它等四个会场进行分组报告，共110场报告。

　　何建国：生态养殖系统可有效防控虾病

　　“虾还能养吗？”国家虾产业技术体系首席科学家何建国在会上直白道。随即，他毫不犹豫地回答称”当然可以，靠什么，就靠生态系统”！何建国认为，对虾肝胰腺坏死症发生的直接原因在于条件致病菌、有害理化因子和有毒藻类三类因子，但根本原因却在于养殖生态系统紊乱，生态系统抗应激能力弱，不能有效控制条件致病菌和有毒藻类的发生。他着重强调”单位时间内”养殖量一旦超过了环境容纳量，有毒理化因子便不能够被消除。

　　何建国认为对虾养殖分为三阶段：

　　养殖早期病害发生机制：在培水期和对虾大量摄食饲料期约30天的早期生态系统，此时池塘营养盐缺乏，不足于使有益藻类和益生菌持续调控生态系统的功能，不足于抑制条件致病菌和有毒藻类的产生。

　　养殖中期病害发生机制：养殖20-70天左右时的中期生态系统，此时随着营养盐大量输入，容易产生老化的藻类和益生菌，非功能性藻类和益生菌过多，失去了生态系统调控功能，生态系统紊乱，且在环境胁迫条件下老化藻类和益生菌大量死亡，不但不能抑制有毒藻类和条件致病菌的发生，而且起到有害的作用。

　　养殖晚期病害发生机制：约养殖70天以后的晚期生态系统，此时营养盐的输入大于有益藻类吸收和益生菌的转化能力，有益藻类和益生菌作用达到最大值，仅依靠有益藻类调控和益生菌调控已经不能维持健康生态系统，这导致对虾养殖难超80天。

　　“养虾一定要使早期生态系统尽快进入中期生态系统，但中期生态系统不要过早的进入晚期生态系统。”何建国建议。

　　Donald V.Lightner：AHPNS最难解决元凶是两种毒素

　　“AHPNS与特异性副溶血性弧菌质粒上编码的PirA和PirB毒素有直接关系。”第九届世界华人虾蟹养殖研讨会期间，美国亚利桑那大学Donald V.Lightner教授表示，目前APHNS的病因已经确定与PirA和PirB两种毒素相关，这个实验成果也得到了台湾成功大学罗竹芳教授的认同，罗竹芳教授的实验证实，副溶血性弧菌之Pir毒素是引起急性肝胰腺坏死之关键。

　　Lightner教授对这两种毒素进行了简单的介绍，PirA和PirB的基因与在植物质粒里的某个基因片段属于并列关系，PirA和PirB这两种毒素与一些植物中发现的物质同源性极高，Pir毒素基因通过质粒基因转录而来，但是质粒是如何进入到虾体的暂时尚不太清楚。可能机制是质粒先进入细菌体内，带质粒的细菌再侵入虾体内。

　　AHPNS的PCR检测明年或列入SPF标准

　　目前，Lightner教授已经对这个130kb大小的质粒进行测序，在已查明的大部分特异性副溶血性弧菌质粒基因中，只有这两个毒素基因起致病作用。

　　“AHPNS是对虾最难解决的疾病。”Lightner教授谈起研究AHPNS的经历，表示当团队最初发现AHPNS现象时，并不清楚是哪些原因致病，随后对收集所得的样本进行一系列的研究，包括病毒检测、切片检测、TCBS测试等，之后发现在TCBS测试中，正常样本应该出现黄色的变为了绿色，最终进行细菌分离得到特异性副溶血性弧菌。

　　发现病原之后，Lightner教授对其致病机理、致病因素都做了一系列的分子检测。”细菌中有一质粒可能引起AHPNS，但要分离这个质粒以及质粒中哪些基因起作用是比较困难，我们（编者注，Lightner与罗竹芳教授合作）需要通过使用分子生物学方法来分离这个130kb的质粒，最终检测到了致病的PirA和PirB基因片段。”Lightner教授表示，毒素主要是通过食道定植感染虾体的肠道和胰脏。

　　目前检测AHPNS最有效的手段就是PCR检测，仅需4个小时即可出结果。Lightner教授表示，预防AHPNS需要从使用SPF亲虾开始，他还表示AHPNS的PCR检测或在2015年加入OIE的SPF亲虾的检测标准条目中。

　　银弹系统仍需进一步的改进

　　去年有报道介绍Lightner教授开发的双氧水（银弹系统）具有很好杀灭副溶血弧菌的效果，但Lightner教授认为还需要做更多的工作来确保银弹系统确实有效对抗AHPNS。

　　“银弹系统的核心是双氧水杀菌，双氧水具有操作简单，浸泡时还能将其它病原杀掉的优势。在实验室条件下双氧水具有很好杀灭副溶血弧菌的效果，但在养殖环境中，有不少非可控因素，团队在墨西哥已进行大规模试验，继续改良银弹系统，希望银弹系统在养殖场中的效果会和实验中一样好。”Lightner教授表示。

　　对虾混养模式前景好

　　对于中国流行的对虾混养模式，Lightner教授也比较看好，并对混养系统中罗非鱼的作用做了介绍：”目前在越南地区，罗非鱼和对虾的混养效果很好，混养对AHPNS的预防有一定的效果，因为罗非鱼能捕食病虾。同时水环境中的藻类优势种也发生了变化，从虾单养的蓝绿藻为主变成绿藻为优势种。这样提供了更加适合虾类生长的环境，根绝虾类病害的源头。”

　　有些养殖户想改养斑节对虾，但是Lightner教授认为南美白对虾依旧有着斑节对虾无法比拟的优势，比如南美白对虾存在生长上的优势，加上斑节对虾也会得AHPNS，所以改养斑节对虾的只会是少数人。

　　Lightner对中国常见的对虾白便病也提出了自己的想法，他认为白便病可能由寄生虫引起，具体可以用PCR和病理切片检查。同时Lightner教授欢迎中国的对虾从业者给亚利桑那大学送样检测。

　　（感谢广东海洋大学陈兆明教授为访谈提供全程精准翻译）

　　罗竹芳：对AHPNS研究的五大进展

　　台湾成功大学罗竹芳教授2013年9月开始参与AHPNS的研究工作，此前国内企业从台湾引进的白斑病的快速检测方法也是源于其团队。本文针对罗竹芳教授目前的研究进展进行解读。

　　首先，需要明确的一点是，此文讨论的AHPNS为Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome（急性肝胰腺坏死综合症），而EMS（早期死亡综合征）则为更广泛的概念，AHPNS属于导致EMS中的一种新病害，其主症状为对虾肝胰腺上皮细胞大量脱落等，具体内容参考DonaldV.Lightner的论文。

　　进展一：证明PirA和PirB是导致AHPNS的病原

　　罗竹芳教授发现副溶血性弧菌质粒pVA1上编码的PirA和PirB毒素的基因片段，并证明PirA和PirB毒素是导致AHPNS的病原。

　　从图1中可以看到，左上角的图片为健康的对照组，右上角为单独的PirA感染对虾导致对虾肝胰腺细胞间出现一些”小泡”，并无较明显症状；左下角为单独的PirB感染对虾，发现对虾肝胰腺上皮细胞出现大量脱落，与AHPNS症状吻合度极高；而使用PirA和PirB同时感染时，则出现了AHPNS。

　　目前，对PirA和PirB的作用机理尚不明确，PirA可能是起某种调控作用。

　　进展二：为什么之前一直难以完成毒素的分离验证实验

　　在副溶血性弧菌的质体上有一个自杀系统，一旦将质粒“拿出”副溶血性弧菌，自杀系统就会“杀死”副溶血性弧菌。这也是原先的病理验证实验比较难突破的地方。

　　进展三：已分离出预防AHPNS的抗体

　　目前罗竹芳教授已经可以制造出Pir毒素的抗体IgY，这种抗体是通过注射到鸡体内获得的，属于对虾的被动性免疫，可以在AHPNS病发之前拌料投喂。抗体的作用主要是与Pir毒素结合后发生中和反应，但抗体还处于定量研究以及成本降低阶段。预计研究成熟后，这种抗体的使用成本能够下降到每公斤饲料仅0.1元台币，合计0.02元人民币。

　　另外，罗竹芳教授也在做别的一些方法抵抗AHPNS，例如阻断毒素与抗体结合。

　　进展四：AHPNS的PCR检测已经确定

　　目前检测AHPNS最精准的手段是PCR检测，在2013年底，罗竹芳教授已经公布了AP1、AP2两个检测序列，这两个序列主要是检测质体，有98%的准确度。目前PCR检测只能定性检测，检出量与发病之间尚未建立线性相关。

　　不过在实验室条件下，105cfu/ml副溶血性弧菌的水体中浸泡对虾20-60分钟，再放到20L的水体中养殖，对虾会60-80%的致死率。

　　进展五：PirA、PirB的结构和昆虫毒素类似

　　如图2所示，左边为苏云金芽孢杆菌Cryinsecticidal毒素的结构，右图为PirA和PirB的结构。两者在蛋白结构上相似程度很高，但是基因相似程度仅10%。苏云金芽孢杆菌具有导致昆虫致死的功能。

　　另外，值得说明的是，在2014年第六届中国对虾产业发展论坛上，何建国教授也发现了苏云金芽孢杆菌可引发对虾AHPNS，昆虫与对虾都属于节肢动物，极有可能是AHPNS的病原。

　　部分报告嘉宾成果摘要：

　　相建海（中国科学院海洋研究所）：良种良法是缺一不可的，优良的品种要与良好的养殖技术相配套，才能让优良的种性得到充分发挥，从而增产增收，否则就是事倍功半。

　　李振声（Hawaii Pacific University）：对南美白对虾、蓝虾、斑节对虾等5种对虾研究，之所以最后选择南美白对虾，是因为南美白对虾生长比较快、在夏威夷有原种、在亚洲市场大、对IHHNV有一定的抵抗作用。

　　江世贵（南海水产研究所）：在中国，对虾产业的恢复是在斑节对虾中开始的，养殖产量一直在6-8万吨。精养量约5%，粗放养殖约占15%。养殖模式的话各种并存：鱼塭、虾蟹混养、高位养殖等。高位养殖亩产大概有1000斤虾。而且这种模式是可持续发展的。但其有个缺点，不可能达到凡纳滨对虾的养殖密度，产量低，仅有400-1500斤的产量。

　　邓东方（Hawaii Pacific University）：浮萍生长速度快，蛋白质在30%，浮萍蛋白可达70%。做蛋白18的鱼粉配方实验，浮萍以0-100%的比例替代虾饲料。当鱼粉替代达到50%，消化率不受影响，50%以上消化率受影响。说明浮萍是有希望的替代源。

　　AmirSagi（Ben-Gurion University of the Negev）：罗氏沼虾雌雄的基因型分为wz和zz，zz型有雄性和雌性，决定zz型转变成雄性的是类胰岛素雄性激素，zz型的在生长周期中有一个能够决定其转变成雄性或者雌性的时间，但这个周期持续20天左右，如果在这一段很短的时间内能够注射一种RNA干扰素（DSRA）针剂，就会使这个雄性不可逆转的永久变成雌性，再拿这个雌性跟zz型的雄性交配，就大大增加了雄性在子代中的比例，以达到提高产量的效果。

　　曾朝曙（James Cook University）：不同个体大小的红螯螯虾对饲料颗粒大小非常敏感，偏大的饲料比合适的饲料花很多时间来摄食，浪费能量。以15-30g的虾为例，食用4.5mm规格饲料需要5分钟；30-50g的虾7mm花了3.8分钟，浪费了9%，4.5mm花了2分钟，浪费5%。推荐不同个体的标准为：5-10g大小是1.0mm，15-30g是2.0mm；30-50g是3.0mm。

　　王华朗（广东恒兴饲料实业股份有限公司）：2003年到2012年里对虾养殖持续上升，2013年略有下降，近年对虾饲料产量从2009到2012年是持续上升，但2013年下降。2014年对虾饲料总量持续增长，珠三角发病多，亩产200-500斤居多。粤东，闽南成功率较高，此区高位池虾塘趋向于小型化，设施立体化，底部、中层、水面增氧。

　　黄倢（黄海水产研究所）：在2012年从中国对虾分离到黄头病毒新型基因型，过去认为在中国不存在，现在看来已经在中国对虾中流行，原来的6个基因型已经扩展到11个基因型。而针对于泰国人说的肠孢子虫，我认为是肠胞虫，症状有时是出现白便，但生长缓慢并不能都是由肠胞虫来解释，因为也有肠胞虫阴性的长不大例子。

　　孙成波（广东海洋大学）：在低温19±1℃条件下，哈维氏弧菌和白斑综合症对凡纳滨对虾的致病力受到抑制；在温度25±1℃条件下，WSSV对对虾的致病力高于哈维氏弧菌的致病力；温度为31±1℃条件下，单独感染WSSV，结果发现WSSV的致病力受到一定抑制。但继发感染哈维氏弧菌会引起WSSV致病力提高，使WSSV在对虾体内增殖加快。

　　朱春华（广东海洋大学）：在肝胰腺中，壬基酚对其有损伤，但处理后它的卵黄蛋白源的表达还是比较活跃。

　　叶宁（广东海洋大学）：虾池底层水（低氧，残饵较多）经底层联通管流进鱼池。经鱼滤食后，采用抽水泵将鱼池面层水抽回虾池、形成增氧利用的循环水系统，达到减排节水的目的。

　　刘金生（上海海洋大学）：河蟹蜕壳生长的最是pH为8-9。

　　徐武杰（南海水产研究所）：碳氮比影响养殖水体生物絮团群落结构及生物量，具体是碳氮比＜12，水体以微藻为主，水色呈绿色；碳氮比＞12，水体以异养菌为主，水色呈黄褐色，生物絮团生物量随着C/N升高增加越快。

　　李健（黄海水产研究所）：预防早期死亡综合症（EMS），氨氮浓度应控制在2.5mg/L以下。

　　何杰（上海海洋大学）：野生扣蟹在池塘内养殖的性腺发育较晚，成熟时间延后，上市时间延迟，可以定程度达到均衡上市的效果。

　　章跃陵（汕头大学）：对虾血蓝蛋白可以产生多个功能性降解片段，推测其可能是对虾抵御不同病原微生物感染的一种新的重要的方式。

　　>>>Donald V Lightner来访首日参观湛江对虾基地

　　由广东海洋大学承办的第九届世界华人虾蟹养殖研讨会12月6日-9日在广东湛江举办。此次研讨会不仅规模空前盛大，并且邀请了对虾病理教父级人物、美国亚利桑那大学Donald V Lightner教授来作报告并访问。据Lightner介绍，这是他第二次访问中国，第一次是在久远的1983年，因此对本次中国行十分期待。12月5日，在广东海洋大学孙成波教授一行的陪同下，Lightner参观了恒兴863基地、广东海洋大学海洋生物研究基地。同时，Lightner还特别要求参观广东的冬棚虾养殖。

　　广东海洋大学海洋生物研究基地占地10公顷，投资3000余万元，设有海洋生物培育车间、室内小型混凝土选育池、室外混凝土选育池、水处理系统等，并配备了价值700万元的仪器设备。在基地参观期间，孙成波教授展示了广东海洋大学海洋生物研究基地的实时养殖监控系统，及8口对虾养殖池塘的EMS治疗成果。据孙成波介绍，主要使用两种方法控制EMS，第一种方法是使用益生菌和副溶血弧菌竞争营养来控制EMS，及噬菌体拌料投喂的方式来控制EMS，并强调使用益生菌的种类和数量非常关键。Lightner查看治疗后的一口池塘中的对虾，表示对虾正在恢复中，并提出使用PCR进行前期诊断。Lightner和孙成波教授商量了后期实验的改善，建议在室内进行治疗实验的方案探讨。（蔡章洁）

　　文/本刊撰稿人 蔡章洁 郭赛