宁宜宝：蓝耳苗应少免产品最好低毒

　　今年4月，由中国兽医药品监察所、广东永顺生物制药股份有限公司（下简称广东永顺）和北京信得威特科技有限公司共同参与研发的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（GDr180株），获得农业部批准为三类新兽药。这也是我国批准的第4个高致病性蓝耳病毒株。

　　之前，高致病性蓝耳毒株已经有JXA1-R、HuN4-F112和TJM-F92三种。但业内普遍认为，目前的蓝耳病疫苗尚不完美，因此新疫苗的签发备受行业关注。

　　GDr180株是否能为我国的蓝耳病防控带来新的突破？新疫苗和以往相比又有哪些进展？为此我们特约GDr180株的研发人之一，中国兽医药品监察所检测技术研究室主任宁宜宝研究员为读者详细解读GDr180株新疫苗的研发过程和产品特点。

　　农财宝典：能为我们介绍一下GDr180株的发现过程吗？

　　宁宜宝：2006年夏天，在我国南方部分省市发生了以猪体温升高、皮肤发红和呼吸困难等主要临床症状的不明猪病，剖检发现以出血性肺炎为主要特点。该病发病率、病死率高，怀孕母猪严重流产，而且治疗无效。因为有体温突然升高到41-42℃的特点，所以当时被称为“高热病”。

　　在对病原不明的情况下，我们将病死猪组织悬液同时接种Vero（非洲绿猴肾细胞）、MDCK（犬肾细胞）、Marc145（猴胚胎肾上皮细胞）和PK（猪肾上皮细胞）4种细胞，发现只有Marc145细胞出现病变，其它三种细胞未发现细胞病变。Marc145细胞对PRRSV（蓝耳病病毒）有特异性，PRRSV可以在其上生长，所以当时我们怀疑是PRRSV，但也不敢确定。因为蓝耳病没有出现过这么高的体温，所以我们分离到病毒之后进行了一系列的鉴定来确诊。

　　我们将分离的病毒液用抗PRRSV高免血清中和后，再接种Marc145细胞，却发现细胞不会出现病变了，由此证明该病毒能被PRRSV抗血清特异性中和。初步认定是一种以PRRSV为主的病原。

　　同时进行核酸序列的测定，进一步确认病原。当时共设计了针对4种病毒的引物，PRRSV、CSFV（猪瘟病毒）、PRV（猪伪狂犬病毒）和PCV2（猪圆环病毒2型）。分别对细胞培养分离出的病毒和用此分离毒人工感染死亡猪的脏器悬液进行扩增。结果除了PRRSV扩增结果为阳性外，其他三种病毒均没有检出。这样基本可以确认是PRRSV。

　　我们将新分离病毒扩增出来的基因片段测序，然后与PRRSV美洲型标准株2332株的基因序列进行比较。对比差异，结果发现细胞分离毒和死亡猪脏器组织中的病毒与美洲型PRRSV同源性非常高。因为经典蓝耳病不能引起高热、高死亡率，所以推测它的基因可能发生了改变。果然，全基因测序结果发现与经典PRRSV同源性只有80.99%，有464个碱基发生了突变。

　　这是一个典型PRRSV变异株。

　　由于当时对于引起“高热病”的病原有不同的猜测，比较多的还有流感病毒和心肌炎，因此我们也通过血清学试验进行鉴别诊断，排除了流感病毒感染。

　　通过这一系列的分离鉴定，才初步确定发生“高热病”的猪体内存在高度变异的PRRSV，但是不是病毒引起的“高热病”，我们还要做下一步致病性分析。

　　农财宝典：致病性分析包括哪些内容？

　　宁宜宝：用新分离的PRRSV原液（病毒滴度：106.5TCID50/ml）以注射和滴鼻的方式同时感染55-60日龄无PRRSV抗原抗体的试验猪。

　　为了模拟南方高热、高湿天气，将试验猪分成两组，一组于36℃左右、高湿条件下饲养，一组20℃左右条件下饲养。结果显示，所有感染猪体温均可升高到41℃以上，出现和猪场发病猪相似的严重临床症状、肺部病变和高死亡率。而且，高温、高湿组感染猪体温更高，临床症状、肺部病变更严重，死亡率也更高。这表明高温、高湿可以加重感染猪发病的严重性，这也和实际当中南方地区的发病情况相吻合。高温、高湿组开始发热的时间也比常温组提前24小时。

　　然后我们取感染猪活体扁桃体和死亡猪器官组织，分别用RT-PCR或PCR方法检测PRRSV、CSFV、PRV和PCV2的核酸，结果所有样品中PRRSV均为阳性，其他三种病毒均为阴性。

　　在试验猪感染25天和35天时，分别采集血清测抗体，结果PRRSV抗体全部为强阳性反应，其他三种病毒抗体均为阴性。

　　最终确认导致“高热病”的病原鉴定结果为HP-PRRSV（高致病性蓝耳病病毒），命名为GD株。

　　农财宝典：那从分离到的强毒株到生产疫苗还需要经历哪些过程呢？

　　宁宜宝：至此我们只是分离到了一株具有高致病性的PRRSV。为了使其制成疫苗，还需要数次传代，使病毒对细胞的适应性更好，培养的病毒含量更高，传的代数越多，毒株的毒力也越低。这个毒株经过细胞传了180代，获得了毒力极低的毒株，才适合做疫苗毒株，这才得到GDr180株。

　　为了确保疫苗毒株的安全性和稳定性，我们还做了一系列试验。从40代起，每10代测一次GD株的毒力，结果表明传代120代以后对猪的毒力明显降低。从60代起，每10代测一次免疫保护力，发现传代至195代仍保持良好免疫原性。

　　制苗后我们还要评价疫苗的安全性。将3批试验疫苗分别以10倍剂量每批接种5头猪，观察体温、临床症状和体重变化。发现接种前后体温变化范围不超过0.2-0.8℃，最高温度也没有超过39.6℃，没有明显的体温升高现象。疫苗接种后21天，比较各组平均日增重，发现与对照组无明显差别，表明注射疫苗对日增重几乎没有影响，观察肺部也没有发现病变。这表明疫苗的安全性比较好。

　　后续我们还对怀孕母猪的安全性、免疫效果、免疫周期等进行了一系列科学严谨的试验研究，最终才有了高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（GDr180株）的诞生。

　　农财宝典：GDr180株蓝耳苗从分离到上市历时9年，为什么这么久？和之前的三个变异株疫苗又有哪些不同呢？

　　宁宜宝：这4种变异株从致弱前的种毒来说，均来源于2006年高致病性猪蓝耳病流行株，尽管是从不同地方分离，但其基因结构几乎一样，完全同源，只是在致弱过程中经细胞传代的代次不同而已。

　　试验证明，4种疫苗的免疫效力差异不显著，但安全性有明显差异，高致病性猪蓝耳病活疫苗（GDr180株）经细胞传代次数达180代，而其他疫苗最高的也未超过130代，传代次数明显高于其他3种疫苗，因而其安全性更好。也是出于这些原因的考虑，我们花费更多的时间进行筛选和传代，以及对安全性试验的研究。蓝耳苗GDr180株的上市，扩充当前高致病性蓝耳毒株的阵容，为养户控制疫情提供新的选择。

　　GDr180毒株高度致弱，安全性更高，接种后不产生猪体温升高等免疫副反应，降低活疫苗排毒风险；该疫苗免疫原性良好，接种后可获得坚强的免疫保护和较长的免疫保护期；与猪瘟疫苗同时免疫，不影响猪瘟疫苗免疫效果。

　　蓝耳苗实际上不能免疫太多次数，长时间高强度的免疫会给猪场带来扩毒以及病毒变异的风险，考虑到扩毒的风险，猪场最好采取低毒的产品。

　　《农财宝典》-新牧网记者 孟轩