阪崎肠杆菌检测方法的研究进展与优化

　　阪崎肠杆菌（EnterobacterSakazakii）是乳制品中近几年新发现的一种致病菌，是肠杆菌科的一种。目前国际社会上针对该菌的研究无论是在医学还是公共卫生学上都具有极其重要的意义。阪崎肠杆菌菌型繁多，传统的血清学鉴定、选择性和非选择性增菌等检测方法存在灵敏度低、耗时长等缺点，难以满足食品及临床应用。国内外学者对阪崎肠杆菌检测技术进行了大量研究，并取得了一定的进展。检测方法主要分为以免疫学为基础的方法、分子生物学方法、联合方法三类方法。该文就这三类方法研究进展进行概述。

　　阪崎肠杆茵的生物学性状及其对人群的健康危害受到人们的关注并被报告。例如，味全配方奶粉2008年年10月份被检出含有致病菌阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的病例已在全球相继出现。多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，在某些情况下，由阪崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达40%～80%。阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视。传统的检测方法存在很多缺点，很难满足现代临床快速诊断和治疗，食品检测的需求。要了解更准确，快速，简便，可靠的方法和技术，科学为此已作了大量的研究，试验方法和识别技术正在不断发展和完善，并在实践中不断取得新的进展，从传统到更敏感的检测方法，比较简单，在发展方向更短的时间。

　　1以免疫学为基础的检测方法

　　免疫学相关技术主要内容是抗原和抗体之间的特异性结合的反应，然后通过免疫放大技术来分辨细菌。由于抗原抗体反应速度快，人们通过这种高灵敏度建立了一系列的检测方法。已经实践了的方法有很多种，大致分为荧光抗体（免疫荧光法），同位素标记抗体（放射免疫试验），酶标抗体（ELISA）为基础方法。

　　2分子生物学方法

　　分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子诊断技术研究取得了很大进展，尤其是核酸探针技术、PCR技术和基因芯片技术的发展又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。

　　聚合酶链反应(PCR)技术。近些年，聚合酶链反应（PCR）技术快速的发展和应用，主要原理是设计特异性引物，从而扩增阪崎肠杆菌中稳定性强的核酸序列，通过试验数据来分析阪崎肠杆菌的存在，因此PCR技术主要在于靶序列的挑选和引物的相关设计。

　　我国用PCR技术检测食物中是否存在阪崎肠杆菌，以牛肉，奶粉，煮熟的鸡肉为试验对象，在实验对象中人工添加阪崎肠杆菌，PCR技术和传统的检测结果一样，检出限为100CFU/25g，准确性达100%。由此说明PCR技术具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等优点，各国学者均致力于PCR方法检测阪崎肠杆菌技术的研究，改进的PCR检测方法发展起来，常见的有荧光定量PCR，多重PCR，随机扩增多态性DNA检测，免疫捕捉PCR，IMS-PCR等。

　　噬菌体裂解试验。噬菌体对细菌有很高的裂解作用，阪崎肠杆菌的高裂解率有利于阪崎肠杆菌的检测，何晓青等发现一种肠杆菌科分属诊断噬菌体，用其鉴定阪崎肠杆菌只要6分钟，加上培养菌落时间都只需2天，该方法可用于阪崎肠杆菌的快速检测，其检测时间短，效率高，方便易行。

　　环介导等温扩增方法。环介导等温扩增方法(LAMP)是一种新兴的核酸扩增方法，2000年日本人TsugunoriNotomi等发现出来的一种新的核酸扩增方法。其原理是通过对靶序列上的6个特定区域设定特定的4条引物，这可以证明出环介导等温扩增技术的特异性高，该文原载于中国社会科学院文献信息中心主办的《环球市场信息导报》杂志http：//www.ems86.com总第565期2014年第33期-----转载须注名来源而扩增过程只需在60-65℃反应60min，扩增效率也是很高，在扩增过程中可生成焦磷酸镁的一种白色沉淀，因此我们可以根据沉淀的浑浊程度来进行判断，LAMP扩增技术与常规的PCR扩增技术相比，不需要繁琐的电泳和紫外观察的过程，也不需要相关PCR仪器，只需要在一段不大于300bp的目的片段上设计6-8(含促环引物)条相关的特异性引物，观察沉淀的浊度，加之用LAMP技术检测阪崎肠杆菌只需2h，即使加上增菌的时间也只有15h，大大的提高的效率，便于基层的广泛使用，具有很高的实用价值。

　　核酸探针。目前，从鼠伤寒阪崎肠杆菌菌株染色体DNA克隆成功的应用检测阪崎肠杆菌属的阪崎肠杆菌探针，应用于食物中阪崎肠杆菌的检测。20世纪80年代中期发展起来的以放射性同位素核糖体核酸（rRNA）探针，但需要要使用有放射性同位素，只能在特殊的实验条件下进行，不能广泛推广应用。Fitts等人运用DNA-RNA杂交技术进行食物中阪崎肠杆菌检测，探针中有同位素特殊的标记，敏感度很高，可以很快的检测出阪崎肠杆菌，通过对阪崎肠杆菌核糖体RNA(rRNA)及核糖体发育过程中储存的核酸成分进行相关的检测。这种天然富含rRNA标靶序列既可以避免了检测放射性同位素特殊实验室的要求，也比传统放射同位素检测更稳定和更高的敏感性。

　　基因芯片技术。基因芯片也称为生物芯片，生物芯片是一种固定着许多知序列DNA探针的硅片或玻片。将通过标记的荧光分子与生物芯片上的固定的探针杂交，通过观察荧光信号的强弱来判断出分子的数量以及序列信息，来推断出是否有目的菌，这种方法可以同时检测出多个菌种，而且灵敏度高，特异性强。对于检测阪崎肠杆菌等相关的致病菌有着很大的应用前景。ChizhikovV等采用寡核苷酸芯片进行相关毒力研究，发现了细菌毒力因子可应用于肠道致病菌的分析检测。

　　3联合方法

　　最新的研究表明，单一的检测方法不能够满足人们对阪崎肠杆菌快速检测的所有要求，近年的研究方向主要集中于多种方法的联合运用上。

　　IMS-PCR。将样品用IMS方法处理后用PCR方法检测可以缩短培养的时间，既满足高特异性，也具有高度敏感性。Wang等将IMS技术与PCR技术联合运用，灵敏度达到103CFU/g[3]。

　　IMS-ELISA。先IMS技术处理后的样品进行ELISA技术检测也可以提高检测的效率，缩短检测的时间。Taha等将鸡翅样品在蛋白胨水中培养4h，运用IMS-ELISA联合方法，整个反应可以在8h内完成，检测灵敏度达1.6×103CFU／mL。

　　噬菌体-生物传感器。噬菌体-联合生物传感器方法能够克服环境因素的干扰。提高了检测的效率，缩短了检测的时间。将鼠伤寒阪崎肠杆菌噬菌体连接无线磁弹性传感器上，在潮湿湿润的环境中，可以准确地检测出阪崎肠杆菌的含量。

　　噬菌体-分子生物学。用噬菌体将某种特异性基因镶嵌到靶细胞的DNA中，通过基因的表达性从而知道靶细胞的相关信息。Kuhn等把1ux基因通过噬菌体镶嵌到阪崎肠杆菌DNA中，可在16h内检测出样品中的阪崎肠杆菌。

　　4展望

　　综上所述，阪崎肠杆菌的检测技术取得了较大的进展。检测方法越来越多，同时也日趋向快速、高灵敏度、高特异性、程序简单化方向发展，这也是食品质量和临床检验的要求。单一技术的检测方法存在不足之处，通过各种技术间相互结合和补充不仅使各自优点得到最大发挥，也弥补了单独一种检测技术的不足，这将是阪崎肠杆菌检测方法的重要一个研究方向。

　　（作者单位：长沙医学院）

　　李帆 文